地龍?zhí)崛∥飪龈煽诒榔闹苽涔に囇芯?/h1>
2021-04-30 03:10:20吳茜李紅鑫李聘吳婧楠孫常勝薛婉瑩郭杏梅孫騰躍蔡程科王洪飛北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京0488北京量子高科制藥科技有限公司北京000
中南藥學(xué) 2021年3期 關(guān)鍵詞：工藝
吳茜，李紅鑫，李聘，吳婧楠，孫常勝，薛婉瑩，郭杏梅，孫騰躍，蔡程科*，王洪飛*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京量子高科制藥科技有限公司，北京 000）
《中國(guó)藥典》2020年版收載地龍來(lái)源于鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓的干燥體，前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。其用于治療高熱神昏，驚癇抽搐，肢體麻木，半身不遂等。現(xiàn)代研究證明地龍主要的化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂肪酸等[2-4]。地龍?zhí)崛∥镏泻欣w溶活性物質(zhì)[5]，可有效溶解血栓，并把這種活性物質(zhì)命名為蚓激酶。研究發(fā)現(xiàn)地龍活性提取物經(jīng)灌胃給藥可減輕大鼠血小板黏附率[6]，提高小鼠紅細(xì)胞變形性[7]。采用鮮地龍煎湯口服配合溫針灸治療半身不遂，具有顯著效果[8]；臨床運(yùn)用復(fù)方地龍膠囊口服可有效治療缺血性中風(fēng)恢復(fù)期[9-10]。地龍品種繁多，來(lái)源廣泛，市售蚓激酶制劑來(lái)源于人工養(yǎng)殖赤子愛(ài)勝蚓，地龍?zhí)崛∥锞哂泻軓?qiáng)的纖溶活性（大于20 000 U·mg－1），分子量主要分布在15 ～60 kDa。地龍?zhí)崛∥飸?yīng)用廣泛，上市劑型均為口服片劑或者膠囊劑，特殊患者服藥困難，臨床應(yīng)用受到限制。口腔崩解片（簡(jiǎn)稱口崩片）可在水中迅速崩解，對(duì)口腔黏膜無(wú)刺激，容易吞咽[11-12]，為特殊患者如老人、小孩、具有精神疾患的人群開(kāi)辟了用藥新途徑。冷凍干燥法干燥溫度低，能夠保存物料中的活性物質(zhì)不發(fā)生改變，可在口腔中迅速崩解，在食品和藥品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13-15]。運(yùn)用凍干技術(shù)制備的口崩片無(wú)需用水送服，可用于吞咽障礙以及昏迷人群，極大地提高了服藥順應(yīng)性。因此本研究采用冷凍干燥法制備地龍口崩片，對(duì)處方組成和凍干工藝進(jìn)行探索。
1 材料
1.1 試藥
地龍?zhí)崛∥铮ㄅ?hào)：20191011，哈爾濱九信醫(yī)藥科技有限公司，規(guī)格：500 g/袋，蛋白含量大于90%）；普魯蘭多糖（批號(hào)：7E1412，日本林原株式會(huì)社）；甘露醇（批號(hào)：1907016，河北華旭藥業(yè)有限公司）；蔗糖（批號(hào)：B10090850，麥克林）；三氯蔗糖（批號(hào)：Z115011708，山東中怡三氯蔗糖制造有限公司）；檸檬香精[批號(hào)：W-FL120053，威爾芬（北京）科技發(fā)展有限公司]。
1.2 儀器
高剪切混合乳化機(jī)（BME100LX，上海威宇機(jī)電制造有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（GLZ-0.4 m3，北京速原真空技術(shù)有限公司）；共晶點(diǎn)測(cè)試儀[RS232，奧特佳美（北京）科技有限公司]。
2 方法與結(jié)果
2.1 地龍?zhí)崛∥飪龈煽诒榔闹苽浞椒?/h3>
按照處方稱取物料置于剪切杯中，水定量至40 g，攪拌均勻，2500 r·min－1剪切5 min，轉(zhuǎn)移至脫氣瓶?jī)?nèi)，磁力攪拌下真空脫氣至無(wú)氣泡。取藥液分裝于泡罩中，0.4 mL/片，置于－60 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍30 min，按照設(shè)定的曲線進(jìn)行凍干，壓力升高試驗(yàn)合格后，出箱。從凍干機(jī)中取出泡罩板，用鋁塑袋熱封包裝。
2.2 地龍?zhí)崛∥飪龈煽诒榔馁|(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
將凍干口崩片的質(zhì)量分為1 ～5 級(jí)，分別計(jì)1、2、3、4、5 分，等級(jí)越高，質(zhì)量越好。外觀評(píng)分取多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的加和總分。
2.2.1 外觀考察
① 顏色：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的顏色，分為五個(gè)等級(jí)。片劑顏色均勻，色澤一致為等級(jí)5；有暈圈，分界不規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的70%～90%為等級(jí)4；有暈圈，分界明顯、規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的60%～70%為等級(jí)3；有暈圈，分界不規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的50%～60%為等級(jí)2；有色澤差異，暈圈不規(guī)則為等級(jí)1。
② 光潔度：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的光潔程度，分為五個(gè)等級(jí)。表面平整光滑為等級(jí)5；表面有麻點(diǎn)、裂紋，面積占比小于10%為等級(jí)4；表面看到明顯細(xì)小裂紋，占比10%～30%為等級(jí)3；表面明顯看到深度裂紋、表面粗糙，占比30%～60%為等級(jí)2；表面嚴(yán)重裂紋，占比大于60%為等級(jí)1。
③ 裂邊：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片表面與邊緣的形態(tài)，分為五個(gè)等級(jí)。邊緣無(wú)裂紋為等級(jí)5；裂邊面積占比小于5%為等級(jí)4；裂邊面積占比5%～15%為等級(jí)3；裂邊面積占比15%～30%為等級(jí)2；裂邊面積占比大于30%為等級(jí)1。
④ 融片：取出片劑，將片劑倒置、掰開(kāi)，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述片劑底部以及斷面的情況，初步判斷有無(wú)融片。由于地龍本身顏色較深，當(dāng)出現(xiàn)融片時(shí)顏色呈棕褐色，與周圍的顏色形成色差。根據(jù)底部以及周邊的顏色判斷有無(wú)融片，分為五個(gè)等級(jí)。底部及周邊無(wú)融化塌陷，顏色均一無(wú)色差為等級(jí)5；有色差，占比小于20%為等級(jí)4；有色差，占比20%～30%為等級(jí)3；有色差，占比30%～40%為等級(jí)2；融化塌陷嚴(yán)重，有色差，占比大于40%為等級(jí)1。
⑤ 飽滿度：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的外形，分為五個(gè)等級(jí)。片子中心鼓起，從中心到邊緣逐步降低，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)5；片子比較平坦，中心略高于邊緣或與邊緣平齊，片面中間無(wú)凹陷，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)4；片中心比邊緣高，片面凹陷，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)3；片中心比邊緣低，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)2；片型凹凸不平為等級(jí)1。
⑥ 完整性：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述片劑與鋁窩粘連后的片劑完整情況，分為五個(gè)等級(jí)。黏壁總面積（底部＋側(cè)面）小于10%為等級(jí)5；黏壁總面積為10%～20%為等級(jí)4；黏壁總面積在20%～30%為等級(jí)3；黏壁總面積在30%～60%為等級(jí)2；黏壁總面積大于60%為等級(jí)1。
2.2.2 口嘗感受
① 口感：取出片劑，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，評(píng)價(jià)口崩片在口腔中的感受。五人同時(shí)口嘗后進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，取平均分?jǐn)?shù)而得。入口即化（時(shí)間小于10 s），無(wú)沙礫感為等級(jí)5；入口崩解較緩（時(shí)間10 ～30 s），有沙礫感為等級(jí)4；入口崩解緩慢（大于30 s），有沙礫感為等級(jí)3；入口崩解緩慢，成團(tuán)，有沙礫感為等級(jí)2；入口成團(tuán)，有沙礫感為等級(jí)1。
② 口味：取出片劑，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，評(píng)價(jià)口崩片在口腔中的味道感受。五人同時(shí)口嘗后進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，取平均分?jǐn)?shù)而得。無(wú)異味、無(wú)苦、無(wú)麻舌、無(wú)刺激感，口味適中為等級(jí)5；有異味、苦、麻舌、刺激感任意1 ～2 項(xiàng)為等級(jí)4；有異味、苦、麻舌、刺激感任意3 項(xiàng)者為等級(jí)3；有異味、苦、麻舌、刺激者為等級(jí)2；異味、苦、麻舌、刺激嚴(yán)重者為等級(jí)1。
2.2.3 崩解 檢測(cè)口崩片的崩解時(shí)間。取片劑6片，分別置于40 mL、（37±2）℃蒸餾水的培養(yǎng)皿中，在入水時(shí)開(kāi)始用秒表計(jì)時(shí)，直到片劑完全崩解，記錄崩解時(shí)間，分為五個(gè)等級(jí)。崩解時(shí)間小于10 s 為等級(jí)5；崩解時(shí)間10 ～15 s 為等級(jí)4；崩解時(shí)間15 ～20 s 為等級(jí)3；崩解時(shí)間大于20 s為等級(jí)4；崩解時(shí)間大于30 s 為等級(jí)1。
2.2.4 微觀結(jié)構(gòu) 評(píng)價(jià)口崩片的孔道排列狀況。取片劑，對(duì)其縱切面進(jìn)行電鏡掃描，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。
2.2.5 生物效價(jià) 精密稱取地龍?zhí)崛∥?2.7 mg、口崩片粉末66.3 mg 于25 mL 量瓶中，加0.9%NaCl 超聲溶解，定容至刻度，備用。纖維蛋白平板法測(cè)定其生物效價(jià)[16]，聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白條帶[17]。評(píng)價(jià)制劑工藝對(duì)生物效價(jià)和蛋白種類的影響。
2.3 處方篩選
預(yù)試驗(yàn)選擇甘露醇作為骨架支撐劑、普魯蘭多糖作為黏合劑，蔗糖、三氯蔗糖和檸檬香精作為調(diào)味劑。固定甘露醇-普魯蘭多糖的質(zhì)量比為1∶1。選擇主藥地龍?zhí)崛∥锖?0 mg/片進(jìn)行處方考察，篩選最佳處方。
2.3.1 甘露醇-普魯蘭多糖用量考察 固定濃度蔗糖2%、三氯蔗糖0.01%、檸檬香精1%，考察1∶1 比例下甘露醇和普魯蘭多糖的濃度對(duì)口崩片外觀性狀（顏色、光潔度、裂邊、融片、飽滿度、完整性）和崩解時(shí)間的影響。考察結(jié)果表明當(dāng)兩者濃度小于4%時(shí)，口崩片顏色不均，塌陷、融片嚴(yán)重，普魯蘭多糖、甘露醇的濃度應(yīng)分別保持在4%及以上的水平以維持片劑的基本骨架形態(tài)。隨著兩者用量增加，在口腔中崩解變緩，但可均勻分散，無(wú)沙礫感，結(jié)果見(jiàn)表1。
2.3.2 蔗糖用量的考察 固定蔗糖、普魯蘭多糖、甘露醇總濃度12%，考察蔗糖濃度對(duì)口崩片外觀和崩解時(shí)間的影響。設(shè)定蔗糖的濃度為2%、4%、6% 3 個(gè)濃度等級(jí)進(jìn)行考察，考察結(jié)果如表2。當(dāng)基質(zhì)總含量保持在12%時(shí)，在口腔中崩解無(wú)差異，隨著蔗糖濃度的增加，口崩片的外觀形態(tài)變差。
2.3.3 口味考察 地龍屬于蟲(chóng)類中藥，蛋白含量豐富，其腥臭味導(dǎo)致患者服藥依從性低。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選取蔗糖、三氯蔗糖、檸檬香精的組合對(duì)口味進(jìn)行改善，結(jié)果見(jiàn)表3。蔗糖濃度的變化對(duì)于甜度的改善不明顯，超過(guò)4%片形變差，但可緩解三氯蔗糖的甜味帶來(lái)的味覺(jué)不適。三氯蔗糖的量在0.03%～0.05%均可接受，而當(dāng)檸檬香精的量小于3%時(shí)，口崩片的腥味仍然較重。
表1 甘露醇-普魯蘭多糖用量考察Tab 1 Pullulan and mannitol dosage
表2 蔗糖用量的考察Tab 2 Sucrose dosage
表3 口味考察Tab 3 Taste investigation
2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方 以片劑外觀、口味、崩解時(shí)間等為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。總分為45 分，取綜合評(píng)分最高者為最優(yōu)處方。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)直觀分析可知，對(duì)片劑質(zhì)量影響程度大小為A ＞C ＞B、D，最佳處方組成為A3B3C3D1，即6%普魯蘭多糖、6%甘露醇、0.05%三氯蔗糖、4%檸檬香精、2%蔗糖。
表4 因素水平表Tab 4 Factor and level
2.4 凍干工藝的篩選
2.4.1 共晶點(diǎn)的測(cè)定 共晶點(diǎn)是指物料中的水分完全凍結(jié)成冰晶時(shí)的溫度。本試驗(yàn)采用電阻法測(cè)量，利用共晶點(diǎn)測(cè)試儀測(cè)得處方溶液的電阻值隨溫度的變化情況，作電阻-溫度散點(diǎn)圖，如圖1。可知，當(dāng)溫度開(kāi)始下降至－22℃時(shí)，電阻值開(kāi)始增大，當(dāng)溫度降至－40℃時(shí)，電阻值達(dá)到最大，此時(shí)的溫度為溶液的共晶點(diǎn)溫度。繼續(xù)降溫一段時(shí)間后開(kāi)始升溫，當(dāng)溫度升至－28℃后，電阻值持續(xù)減小，－28℃為溶液的共熔點(diǎn)溫度。以溶液的共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)溫度作為參考調(diào)整凍干工藝。
表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Experimental results
圖1 共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)Fig 1 Eutectic point and eutectic melting point
2.4.2 凍干工藝的篩選 凍干工藝直接影響片劑的外觀和微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響崩解。采用優(yōu)化得到的處方進(jìn)行制備，以凍干片的外觀、崩解時(shí)間和微觀結(jié)構(gòu)為指標(biāo)對(duì)凍干曲線進(jìn)行篩選。凍干曲線變化如下：
預(yù)試驗(yàn)曲線：升溫至－32℃進(jìn)箱，－30℃維持30 min；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至25 ℃，維持1.5 h。升溫速率均為1 ℃·min－1，真空度范圍為10 ～20 Pa。
曲線一：升溫至－32 ℃進(jìn)箱，－30 ℃維持1 h；升溫至－20 ℃，維持1 h；升溫至－10 ℃，維持1 h；升溫至25 ℃，維持1 h。
曲線二：升溫至－32 ℃進(jìn)箱，－30℃維持1 h；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至0℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
曲線三：－32℃進(jìn)箱，升溫至－30℃維持2 h；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
曲線四：－32 ℃進(jìn)箱，升溫至－30℃維持30 min；升溫至－20℃，維持1.5 h；升溫至0℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
表6 凍干曲線的篩選Tab 6 Screaning of freeze-drying curve
曲線五：－32℃進(jìn)箱，升溫至－30 ℃維持30 min；升溫至－20℃，維持2 h；升溫至25 ℃，維持1.5 h。
篩選結(jié)果如表6 所示，微觀結(jié)構(gòu)如圖2。綜合選擇曲線四為最優(yōu)凍干曲線。
2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)
按照優(yōu)選的處方工藝平行制備3 批樣品，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，3 批口崩片顏色均勻，片形飽滿，表面光潔，無(wú)裂邊，無(wú)融片，完整性好，微觀結(jié)構(gòu)排列有序，在水中快速崩解，入口即化，無(wú)沙礫感，無(wú)異味，微觀結(jié)構(gòu)排列有序（見(jiàn)圖3）。制劑前后蛋白條帶一致，生物效價(jià)無(wú)明顯改變（見(jiàn)圖4），證明處方工藝、凍干工藝穩(wěn)定可行。可進(jìn)行工藝放大研究。
3 討論
甘露醇和普魯蘭多糖的比例和含量對(duì)片劑的基本骨架起著決定作用，當(dāng)兩者含量均大于4%時(shí)片劑成形性基本合格；地龍獨(dú)特的腥臭味造成服藥困難，三氯蔗糖和檸檬香精可矯正和掩蓋不良?xì)馕叮蟠筇岣呋颊咭缽男裕崽浅Ｓ米鲀龈芍苿┑谋Ｗo(hù)劑，本試驗(yàn)中蔗糖用于矯味，但用量過(guò)大，片形變差，可能與其降低溶液的共晶點(diǎn)有關(guān)，導(dǎo)致凍干條件變苛刻，故僅少量使用以平衡因加入三氯蔗糖造成的味覺(jué)不適。
維持干燥箱內(nèi)的低壓可降低水蒸氣分壓，使水分能夠在低溫下快速蒸發(fā)，干燥的同時(shí)不會(huì)使物料的性狀發(fā)生改變，在凍干過(guò)程中，真空度的穩(wěn)定對(duì)保證產(chǎn)品的質(zhì)量有重要作用。真空度越高，可在更低的溫度實(shí)現(xiàn)升華干燥。若產(chǎn)品的共熔點(diǎn)溫度低，而真空度達(dá)不到此溫度下升華的要求，會(huì)因融片而導(dǎo)致外觀塌陷，片子變硬等。維持較高的真空度并使其穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)是保證整個(gè)凍干過(guò)程順利進(jìn)行的重要因素，一般凍干水溶液時(shí)真空度保持在10 ～30 Pa，本試驗(yàn)中真空度可穩(wěn)定保持在10 ～20 Pa。
圖2 不同凍干工藝條件下片劑的微觀結(jié)構(gòu)（×100 μm）Fig 2 Microstructure feature at different freeze-drying Process（×100 μm）
升華溫度過(guò)高或升溫速度過(guò)快會(huì)造成片劑塌陷。一般在低于共熔點(diǎn)溫度處進(jìn)行升華干燥，但此溶液共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)溫度低，升華溫度過(guò)低造成水分蒸發(fā)很慢，致使形成的孔道很小，溫度升高容易導(dǎo)致脆弱細(xì)小的骨架無(wú)法支撐而塌陷，緩慢的升溫有利于維持其骨架結(jié)構(gòu)，但耗能增大，造成崩解時(shí)間整體延長(zhǎng)且有團(tuán)塊，微觀結(jié)構(gòu)雜亂不規(guī)則；試驗(yàn)選擇在低于共熔點(diǎn)溫度維持一段時(shí)間，在共熔點(diǎn)曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)－20℃維持較長(zhǎng)時(shí)間，此時(shí)水分蒸發(fā)的速度加快，形成的孔隙和骨架更大，保證其不會(huì)發(fā)生塌陷，制備得到的片劑片形良好，崩解快，微觀結(jié)構(gòu)規(guī)則有序。
圖3 3 批次微觀結(jié)構(gòu)（×100 μm）Fig 3 Microstructure of 3 batches（×100 μm）
圖4 制劑前后蛋白條帶（A）和制劑前后生物效價(jià)對(duì)比（B）Fig 4 Comparison of protein bands（A）and biological value（B）after preparation
本研究運(yùn)用冷凍干燥技術(shù)制備地龍?zhí)崛∥锟诒榔酝庥^、口味、崩解時(shí)間等為指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)考察篩選處方組成，以微觀結(jié)構(gòu)和崩解時(shí)間為指標(biāo)篩選凍干工藝，成功制備得到30 mg/片的凍干型口崩片并進(jìn)行了工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)最優(yōu)工藝制備得到的3 批樣品外觀良好，崩解時(shí)間均小于10 s，微觀結(jié)構(gòu)排列有序，入口即化，無(wú)沙礫感。制劑前后蛋白條帶以及生物效價(jià)均未發(fā)生明顯改變，說(shuō)明此工藝條件對(duì)地龍纖溶活性物質(zhì)無(wú)顯著影響，具有穩(wěn)定性和可行性。
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《中國(guó)藥典》2020年版收載地龍來(lái)源于鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓的干燥體，前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。其用于治療高熱神昏，驚癇抽搐，肢體麻木，半身不遂等。現(xiàn)代研究證明地龍主要的化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂肪酸等[2-4]。地龍?zhí)崛∥镏泻欣w溶活性物質(zhì)[5]，可有效溶解血栓，并把這種活性物質(zhì)命名為蚓激酶。研究發(fā)現(xiàn)地龍活性提取物經(jīng)灌胃給藥可減輕大鼠血小板黏附率[6]，提高小鼠紅細(xì)胞變形性[7]。采用鮮地龍煎湯口服配合溫針灸治療半身不遂，具有顯著效果[8]；臨床運(yùn)用復(fù)方地龍膠囊口服可有效治療缺血性中風(fēng)恢復(fù)期[9-10]。地龍品種繁多，來(lái)源廣泛，市售蚓激酶制劑來(lái)源于人工養(yǎng)殖赤子愛(ài)勝蚓，地龍?zhí)崛∥锞哂泻軓?qiáng)的纖溶活性（大于20 000 U·mg－1），分子量主要分布在15 ～60 kDa。地龍?zhí)崛∥飸?yīng)用廣泛，上市劑型均為口服片劑或者膠囊劑，特殊患者服藥困難，臨床應(yīng)用受到限制。口腔崩解片（簡(jiǎn)稱口崩片）可在水中迅速崩解，對(duì)口腔黏膜無(wú)刺激，容易吞咽[11-12]，為特殊患者如老人、小孩、具有精神疾患的人群開(kāi)辟了用藥新途徑。冷凍干燥法干燥溫度低，能夠保存物料中的活性物質(zhì)不發(fā)生改變，可在口腔中迅速崩解，在食品和藥品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13-15]。運(yùn)用凍干技術(shù)制備的口崩片無(wú)需用水送服，可用于吞咽障礙以及昏迷人群，極大地提高了服藥順應(yīng)性。因此本研究采用冷凍干燥法制備地龍口崩片，對(duì)處方組成和凍干工藝進(jìn)行探索。
1 材料
1.1 試藥
地龍?zhí)崛∥铮ㄅ?hào)：20191011，哈爾濱九信醫(yī)藥科技有限公司，規(guī)格：500 g/袋，蛋白含量大于90%）；普魯蘭多糖（批號(hào)：7E1412，日本林原株式會(huì)社）；甘露醇（批號(hào)：1907016，河北華旭藥業(yè)有限公司）；蔗糖（批號(hào)：B10090850，麥克林）；三氯蔗糖（批號(hào)：Z115011708，山東中怡三氯蔗糖制造有限公司）；檸檬香精[批號(hào)：W-FL120053，威爾芬（北京）科技發(fā)展有限公司]。
1.2 儀器
高剪切混合乳化機(jī)（BME100LX，上海威宇機(jī)電制造有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（GLZ-0.4 m3，北京速原真空技術(shù)有限公司）；共晶點(diǎn)測(cè)試儀[RS232，奧特佳美（北京）科技有限公司]。
2 方法與結(jié)果
2.1 地龍?zhí)崛∥飪龈煽诒榔闹苽浞椒?/h3>
按照處方稱取物料置于剪切杯中，水定量至40 g，攪拌均勻，2500 r·min－1剪切5 min，轉(zhuǎn)移至脫氣瓶?jī)?nèi)，磁力攪拌下真空脫氣至無(wú)氣泡。取藥液分裝于泡罩中，0.4 mL/片，置于－60 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍30 min，按照設(shè)定的曲線進(jìn)行凍干，壓力升高試驗(yàn)合格后，出箱。從凍干機(jī)中取出泡罩板，用鋁塑袋熱封包裝。
2.2 地龍?zhí)崛∥飪龈煽诒榔馁|(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
將凍干口崩片的質(zhì)量分為1 ～5 級(jí)，分別計(jì)1、2、3、4、5 分，等級(jí)越高，質(zhì)量越好。外觀評(píng)分取多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的加和總分。
2.2.1 外觀考察
① 顏色：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的顏色，分為五個(gè)等級(jí)。片劑顏色均勻，色澤一致為等級(jí)5；有暈圈，分界不規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的70%～90%為等級(jí)4；有暈圈，分界明顯、規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的60%～70%為等級(jí)3；有暈圈，分界不規(guī)則，片面一種顏色占片劑表面積的50%～60%為等級(jí)2；有色澤差異，暈圈不規(guī)則為等級(jí)1。
② 光潔度：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的光潔程度，分為五個(gè)等級(jí)。表面平整光滑為等級(jí)5；表面有麻點(diǎn)、裂紋，面積占比小于10%為等級(jí)4；表面看到明顯細(xì)小裂紋，占比10%～30%為等級(jí)3；表面明顯看到深度裂紋、表面粗糙，占比30%～60%為等級(jí)2；表面嚴(yán)重裂紋，占比大于60%為等級(jí)1。
③ 裂邊：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片表面與邊緣的形態(tài)，分為五個(gè)等級(jí)。邊緣無(wú)裂紋為等級(jí)5；裂邊面積占比小于5%為等級(jí)4；裂邊面積占比5%～15%為等級(jí)3；裂邊面積占比15%～30%為等級(jí)2；裂邊面積占比大于30%為等級(jí)1。
④ 融片：取出片劑，將片劑倒置、掰開(kāi)，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述片劑底部以及斷面的情況，初步判斷有無(wú)融片。由于地龍本身顏色較深，當(dāng)出現(xiàn)融片時(shí)顏色呈棕褐色，與周圍的顏色形成色差。根據(jù)底部以及周邊的顏色判斷有無(wú)融片，分為五個(gè)等級(jí)。底部及周邊無(wú)融化塌陷，顏色均一無(wú)色差為等級(jí)5；有色差，占比小于20%為等級(jí)4；有色差，占比20%～30%為等級(jí)3；有色差，占比30%～40%為等級(jí)2；融化塌陷嚴(yán)重，有色差，占比大于40%為等級(jí)1。
⑤ 飽滿度：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述口崩片的外形，分為五個(gè)等級(jí)。片子中心鼓起，從中心到邊緣逐步降低，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)5；片子比較平坦，中心略高于邊緣或與邊緣平齊，片面中間無(wú)凹陷，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)4；片中心比邊緣高，片面凹陷，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)3；片中心比邊緣低，片子全部覆蓋鋁窩為等級(jí)2；片型凹凸不平為等級(jí)1。
⑥ 完整性：取出片劑，在光線明亮的地方進(jìn)行觀察，描述片劑與鋁窩粘連后的片劑完整情況，分為五個(gè)等級(jí)。黏壁總面積（底部＋側(cè)面）小于10%為等級(jí)5；黏壁總面積為10%～20%為等級(jí)4；黏壁總面積在20%～30%為等級(jí)3；黏壁總面積在30%～60%為等級(jí)2；黏壁總面積大于60%為等級(jí)1。
2.2.2 口嘗感受
① 口感：取出片劑，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，評(píng)價(jià)口崩片在口腔中的感受。五人同時(shí)口嘗后進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，取平均分?jǐn)?shù)而得。入口即化（時(shí)間小于10 s），無(wú)沙礫感為等級(jí)5；入口崩解較緩（時(shí)間10 ～30 s），有沙礫感為等級(jí)4；入口崩解緩慢（大于30 s），有沙礫感為等級(jí)3；入口崩解緩慢，成團(tuán)，有沙礫感為等級(jí)2；入口成團(tuán)，有沙礫感為等級(jí)1。
② 口味：取出片劑，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，評(píng)價(jià)口崩片在口腔中的味道感受。五人同時(shí)口嘗后進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，取平均分?jǐn)?shù)而得。無(wú)異味、無(wú)苦、無(wú)麻舌、無(wú)刺激感，口味適中為等級(jí)5；有異味、苦、麻舌、刺激感任意1 ～2 項(xiàng)為等級(jí)4；有異味、苦、麻舌、刺激感任意3 項(xiàng)者為等級(jí)3；有異味、苦、麻舌、刺激者為等級(jí)2；異味、苦、麻舌、刺激嚴(yán)重者為等級(jí)1。
2.2.3 崩解 檢測(cè)口崩片的崩解時(shí)間。取片劑6片，分別置于40 mL、（37±2）℃蒸餾水的培養(yǎng)皿中，在入水時(shí)開(kāi)始用秒表計(jì)時(shí)，直到片劑完全崩解，記錄崩解時(shí)間，分為五個(gè)等級(jí)。崩解時(shí)間小于10 s 為等級(jí)5；崩解時(shí)間10 ～15 s 為等級(jí)4；崩解時(shí)間15 ～20 s 為等級(jí)3；崩解時(shí)間大于20 s為等級(jí)4；崩解時(shí)間大于30 s 為等級(jí)1。
2.2.4 微觀結(jié)構(gòu) 評(píng)價(jià)口崩片的孔道排列狀況。取片劑，對(duì)其縱切面進(jìn)行電鏡掃描，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。
2.2.5 生物效價(jià) 精密稱取地龍?zhí)崛∥?2.7 mg、口崩片粉末66.3 mg 于25 mL 量瓶中，加0.9%NaCl 超聲溶解，定容至刻度，備用。纖維蛋白平板法測(cè)定其生物效價(jià)[16]，聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白條帶[17]。評(píng)價(jià)制劑工藝對(duì)生物效價(jià)和蛋白種類的影響。
2.3 處方篩選
預(yù)試驗(yàn)選擇甘露醇作為骨架支撐劑、普魯蘭多糖作為黏合劑，蔗糖、三氯蔗糖和檸檬香精作為調(diào)味劑。固定甘露醇-普魯蘭多糖的質(zhì)量比為1∶1。選擇主藥地龍?zhí)崛∥锖?0 mg/片進(jìn)行處方考察，篩選最佳處方。
2.3.1 甘露醇-普魯蘭多糖用量考察 固定濃度蔗糖2%、三氯蔗糖0.01%、檸檬香精1%，考察1∶1 比例下甘露醇和普魯蘭多糖的濃度對(duì)口崩片外觀性狀（顏色、光潔度、裂邊、融片、飽滿度、完整性）和崩解時(shí)間的影響。考察結(jié)果表明當(dāng)兩者濃度小于4%時(shí)，口崩片顏色不均，塌陷、融片嚴(yán)重，普魯蘭多糖、甘露醇的濃度應(yīng)分別保持在4%及以上的水平以維持片劑的基本骨架形態(tài)。隨著兩者用量增加，在口腔中崩解變緩，但可均勻分散，無(wú)沙礫感，結(jié)果見(jiàn)表1。
2.3.2 蔗糖用量的考察 固定蔗糖、普魯蘭多糖、甘露醇總濃度12%，考察蔗糖濃度對(duì)口崩片外觀和崩解時(shí)間的影響。設(shè)定蔗糖的濃度為2%、4%、6% 3 個(gè)濃度等級(jí)進(jìn)行考察，考察結(jié)果如表2。當(dāng)基質(zhì)總含量保持在12%時(shí)，在口腔中崩解無(wú)差異，隨著蔗糖濃度的增加，口崩片的外觀形態(tài)變差。
2.3.3 口味考察 地龍屬于蟲(chóng)類中藥，蛋白含量豐富，其腥臭味導(dǎo)致患者服藥依從性低。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選取蔗糖、三氯蔗糖、檸檬香精的組合對(duì)口味進(jìn)行改善，結(jié)果見(jiàn)表3。蔗糖濃度的變化對(duì)于甜度的改善不明顯，超過(guò)4%片形變差，但可緩解三氯蔗糖的甜味帶來(lái)的味覺(jué)不適。三氯蔗糖的量在0.03%～0.05%均可接受，而當(dāng)檸檬香精的量小于3%時(shí)，口崩片的腥味仍然較重。
表1 甘露醇-普魯蘭多糖用量考察Tab 1 Pullulan and mannitol dosage
表2 蔗糖用量的考察Tab 2 Sucrose dosage
表3 口味考察Tab 3 Taste investigation
2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方 以片劑外觀、口味、崩解時(shí)間等為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。總分為45 分，取綜合評(píng)分最高者為最優(yōu)處方。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)直觀分析可知，對(duì)片劑質(zhì)量影響程度大小為A ＞C ＞B、D，最佳處方組成為A3B3C3D1，即6%普魯蘭多糖、6%甘露醇、0.05%三氯蔗糖、4%檸檬香精、2%蔗糖。
表4 因素水平表Tab 4 Factor and level
2.4 凍干工藝的篩選
2.4.1 共晶點(diǎn)的測(cè)定 共晶點(diǎn)是指物料中的水分完全凍結(jié)成冰晶時(shí)的溫度。本試驗(yàn)采用電阻法測(cè)量，利用共晶點(diǎn)測(cè)試儀測(cè)得處方溶液的電阻值隨溫度的變化情況，作電阻-溫度散點(diǎn)圖，如圖1。可知，當(dāng)溫度開(kāi)始下降至－22℃時(shí)，電阻值開(kāi)始增大，當(dāng)溫度降至－40℃時(shí)，電阻值達(dá)到最大，此時(shí)的溫度為溶液的共晶點(diǎn)溫度。繼續(xù)降溫一段時(shí)間后開(kāi)始升溫，當(dāng)溫度升至－28℃后，電阻值持續(xù)減小，－28℃為溶液的共熔點(diǎn)溫度。以溶液的共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)溫度作為參考調(diào)整凍干工藝。
表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Experimental results
圖1 共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)Fig 1 Eutectic point and eutectic melting point
2.4.2 凍干工藝的篩選 凍干工藝直接影響片劑的外觀和微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響崩解。采用優(yōu)化得到的處方進(jìn)行制備，以凍干片的外觀、崩解時(shí)間和微觀結(jié)構(gòu)為指標(biāo)對(duì)凍干曲線進(jìn)行篩選。凍干曲線變化如下：
預(yù)試驗(yàn)曲線：升溫至－32℃進(jìn)箱，－30℃維持30 min；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至25 ℃，維持1.5 h。升溫速率均為1 ℃·min－1，真空度范圍為10 ～20 Pa。
曲線一：升溫至－32 ℃進(jìn)箱，－30 ℃維持1 h；升溫至－20 ℃，維持1 h；升溫至－10 ℃，維持1 h；升溫至25 ℃，維持1 h。
曲線二：升溫至－32 ℃進(jìn)箱，－30℃維持1 h；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至0℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
曲線三：－32℃進(jìn)箱，升溫至－30℃維持2 h；升溫至－15℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
曲線四：－32 ℃進(jìn)箱，升溫至－30℃維持30 min；升溫至－20℃，維持1.5 h；升溫至0℃，維持1 h；升溫至25℃，維持1 h。
表6 凍干曲線的篩選Tab 6 Screaning of freeze-drying curve
曲線五：－32℃進(jìn)箱，升溫至－30 ℃維持30 min；升溫至－20℃，維持2 h；升溫至25 ℃，維持1.5 h。
篩選結(jié)果如表6 所示，微觀結(jié)構(gòu)如圖2。綜合選擇曲線四為最優(yōu)凍干曲線。
2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)
按照優(yōu)選的處方工藝平行制備3 批樣品，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，3 批口崩片顏色均勻，片形飽滿，表面光潔，無(wú)裂邊，無(wú)融片，完整性好，微觀結(jié)構(gòu)排列有序，在水中快速崩解，入口即化，無(wú)沙礫感，無(wú)異味，微觀結(jié)構(gòu)排列有序（見(jiàn)圖3）。制劑前后蛋白條帶一致，生物效價(jià)無(wú)明顯改變（見(jiàn)圖4），證明處方工藝、凍干工藝穩(wěn)定可行。可進(jìn)行工藝放大研究。
3 討論
甘露醇和普魯蘭多糖的比例和含量對(duì)片劑的基本骨架起著決定作用，當(dāng)兩者含量均大于4%時(shí)片劑成形性基本合格；地龍獨(dú)特的腥臭味造成服藥困難，三氯蔗糖和檸檬香精可矯正和掩蓋不良?xì)馕叮蟠筇岣呋颊咭缽男裕崽浅Ｓ米鲀龈芍苿┑谋Ｗo(hù)劑，本試驗(yàn)中蔗糖用于矯味，但用量過(guò)大，片形變差，可能與其降低溶液的共晶點(diǎn)有關(guān)，導(dǎo)致凍干條件變苛刻，故僅少量使用以平衡因加入三氯蔗糖造成的味覺(jué)不適。
維持干燥箱內(nèi)的低壓可降低水蒸氣分壓，使水分能夠在低溫下快速蒸發(fā)，干燥的同時(shí)不會(huì)使物料的性狀發(fā)生改變，在凍干過(guò)程中，真空度的穩(wěn)定對(duì)保證產(chǎn)品的質(zhì)量有重要作用。真空度越高，可在更低的溫度實(shí)現(xiàn)升華干燥。若產(chǎn)品的共熔點(diǎn)溫度低，而真空度達(dá)不到此溫度下升華的要求，會(huì)因融片而導(dǎo)致外觀塌陷，片子變硬等。維持較高的真空度并使其穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)是保證整個(gè)凍干過(guò)程順利進(jìn)行的重要因素，一般凍干水溶液時(shí)真空度保持在10 ～30 Pa，本試驗(yàn)中真空度可穩(wěn)定保持在10 ～20 Pa。
圖2 不同凍干工藝條件下片劑的微觀結(jié)構(gòu)（×100 μm）Fig 2 Microstructure feature at different freeze-drying Process（×100 μm）
升華溫度過(guò)高或升溫速度過(guò)快會(huì)造成片劑塌陷。一般在低于共熔點(diǎn)溫度處進(jìn)行升華干燥，但此溶液共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)溫度低，升華溫度過(guò)低造成水分蒸發(fā)很慢，致使形成的孔道很小，溫度升高容易導(dǎo)致脆弱細(xì)小的骨架無(wú)法支撐而塌陷，緩慢的升溫有利于維持其骨架結(jié)構(gòu)，但耗能增大，造成崩解時(shí)間整體延長(zhǎng)且有團(tuán)塊，微觀結(jié)構(gòu)雜亂不規(guī)則；試驗(yàn)選擇在低于共熔點(diǎn)溫度維持一段時(shí)間，在共熔點(diǎn)曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)－20℃維持較長(zhǎng)時(shí)間，此時(shí)水分蒸發(fā)的速度加快，形成的孔隙和骨架更大，保證其不會(huì)發(fā)生塌陷，制備得到的片劑片形良好，崩解快，微觀結(jié)構(gòu)規(guī)則有序。
圖3 3 批次微觀結(jié)構(gòu)（×100 μm）Fig 3 Microstructure of 3 batches（×100 μm）
圖4 制劑前后蛋白條帶（A）和制劑前后生物效價(jià)對(duì)比（B）Fig 4 Comparison of protein bands（A）and biological value（B）after preparation
本研究運(yùn)用冷凍干燥技術(shù)制備地龍?zhí)崛∥锟诒榔酝庥^、口味、崩解時(shí)間等為指標(biāo)進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)考察篩選處方組成，以微觀結(jié)構(gòu)和崩解時(shí)間為指標(biāo)篩選凍干工藝，成功制備得到30 mg/片的凍干型口崩片并進(jìn)行了工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)最優(yōu)工藝制備得到的3 批樣品外觀良好，崩解時(shí)間均小于10 s，微觀結(jié)構(gòu)排列有序，入口即化，無(wú)沙礫感。制劑前后蛋白條帶以及生物效價(jià)均未發(fā)生明顯改變，說(shuō)明此工藝條件對(duì)地龍纖溶活性物質(zhì)無(wú)顯著影響，具有穩(wěn)定性和可行性。
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