六味地黃丸含藥血清通過Caspase-1/GSDMD-N通路對Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響

高琳琳，趙丹玉，馮曉帆，張林，朱仲康，張欣，柳春（遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s diseases，AD）是老年人最常見的一種漸進性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上常表現(xiàn)為進行性記憶力障礙、認知功能障礙等[1]。據(jù)調(diào)查，目前全球有4680 萬人患AD，預計至2050年，數(shù)值將達到1.3 億多[2]。導致AD 的病理機制可能有β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積、Tau 蛋白的過度磷酸化、膽堿能神經(jīng)元丟失等，其中Aβ沉積被廣泛認為是AD 發(fā)病的關(guān)鍵[3-6]。

近些年來，細胞焦亡已成為當今醫(yī)學界的研究熱門，細胞焦亡作為一種新的細胞程序性死亡，是一種依賴于Gasdermin 蛋白家族的細胞免疫炎性反應而致的死亡。李昕[7]認為腦梗死患者的神經(jīng)細胞可發(fā)生焦亡，發(fā)病的關(guān)鍵在于肝腎虧虛，用填精益腎的方法可改善此病，可見腎虛與焦亡具有聯(lián)系。諸多實驗表明，細胞焦亡可誘發(fā)細胞免疫炎性反應，與AD 的關(guān)系密切相關(guān)[8]。

傳統(tǒng)醫(yī)學對AD 早有記載，AD 屬于中醫(yī)“老年癡呆”范疇。中醫(yī)學認為，癡呆的病機為髓減腦消，神機失用[9]。腦髓的減少是老年癡呆發(fā)病的關(guān)鍵，老年癡呆癥的病位在腦，而五臟六腑的氣血失調(diào)也可導致腦髓的減少。《靈樞》中記載“人始生，先成精，精成而腦髓生”，說明腎可主骨生髓，腎精與腦具有密切聯(lián)系，癡呆的發(fā)生歸于腎精的減少[10]。張娜等[11]通過相關(guān)研究證明地黃飲子具有滋腎陰、補腎陽的功效，可以有效地改善AD 的認知和記憶狀態(tài)。六味地黃丸是滋陰補腎的經(jīng)典名方，有滋陰填精、補益肝腎之功效，可以治療腎陰精不足等癥。王紅梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可通過補腎填精作用，來改善老年癡呆癥狀。崔勇[13]也認為六味地黃丸可以有效減輕中樞免疫反應，起到抑制AD 的作用。以上諸多研究表明，焦亡與炎性反應的關(guān)系十分密切，通過益腎填精可以減輕腦內(nèi)炎性反應，進而改善AD 的發(fā)生發(fā)展，但益腎填精對于焦亡的調(diào)控鮮有報道。因此，本研究從Caspase-1/GSDMD-N 通路來觀察六味地黃丸對焦亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD 大鼠30 只，SPF 級[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0002； 許可證號SYXK（遼）2015-0001，動物實驗于中國醫(yī)科大學實驗動物部進行，倫理委員會批準號：IACUC.2018019]。

1.2 細胞株

人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 試藥

六味地黃丸濃縮丸（北京同仁堂科技發(fā)展有限公司，批號：Z11021283，每8 丸相當于生藥3 g）；Aβ1-42（美 國ANASPEC 公 司， 批 號：AS-20276）；胰蛋白酶（美國Gibco 公司，批號：25200-056）；PBS 緩沖液（美國HyClone 公司，批號：SH30256.01）；胎牛血清（FBS）（塞爾樂生物科技有限公司，批號：F41704）；IL-1β、IL-18酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司，批號分別為ml058059、ml058055）；Caspase-1（批號：ab207802）、GSDMD-N（批號：ab215203）（英國Abcam 公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、全蛋白抽提試劑盒、Western 及IP 細胞裂解液、SDSPAGE 凝膠電泳試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號分別為KGM12800-500、KGP2100、KGP701、KGP113、KGP903）；Invent 總蛋白提取試劑盒（美國Invent公司，批號：SD001/SN002）；ECL 檢測試劑盒（德國Millopore 公司，批號：WBKLS0100）；預染蛋白分子量（中國Bio-Platform，批號：Bpwb10102）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y 細胞用含10%FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 六味地黃丸含藥血清的制備

SD 大鼠30 只，適應性喂養(yǎng)2 ～3 d 后，隨機分為正常對照組和六味地黃丸組，每組15 只，分籠飼養(yǎng)，根據(jù)人與大鼠體表面積有效劑量換算，六味地黃丸組用含六味地黃丸生藥量1.18 g·kg－1的六味地黃丸粉末水溶液灌胃（根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)，篩選出最適濃度[14]），正常對照組用等體積量的雙蒸水灌胃。連續(xù)灌胃1 周后，兩組同時腹主動脈采血，室溫靜置2 h，2000 r·min－1離心10 min，分離血清，即得到正常對照血清和含藥血清。血清于56℃，30 min 滅活，0.22 μm 濾膜過濾分裝，置－80℃冰箱備用[14]。

2.3 細胞模型的制備

細胞實驗分為正常對照組、模型組和六味地黃丸含藥血清組3 組。正常對照組細胞加入含正常對照血清的完全培養(yǎng)基；模型組細胞加入含正常對照血清的完全培養(yǎng)基和20 μmol·L－1的Aβ1-42；含藥血清組細胞加入含六味地黃丸的含藥血清（根據(jù)預實驗CCK-8 結(jié)果，確定六味地黃丸含藥血清篩選的最終濃度為100%）的完全培養(yǎng)基和20 μmol·L－1的Aβ1-42。

2.4 臺盼藍染色法檢測細胞成活率

棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗細胞一遍，加入臺盼藍染色3 min 后，棄去染液，鏡下觀察細胞狀態(tài)，計算活細胞與死細胞數(shù)量，活細胞率＝活細胞總數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.5 ELISA 法檢測IL-1β 和IL-18 的含量

取細胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書測定IL-1β和IL-18 的含量。

2.6 Western blot 法檢測Caspase-1、GSDMD-N 蛋白的表達

Invent 試劑盒法提取蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，將 PVDF 膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩，封閉1.5 ～2 h。將膜放入含一抗的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，次日吸棄一抗，TBST 洗5 min×3 次。再用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（1∶8000），室溫搖床振蕩反應 1 ～2 h，用 TBST洗膜5 ～10 min×3 次。顯色，凝膠成像儀成像。用Gel-Pro Analyzer 4 軟件對結(jié)果進行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計分析

運用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析方法（ANOVA），以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 臺盼藍染色結(jié)果

鏡下觀察，正常對照組細胞形態(tài)較好，結(jié)構(gòu)清晰，胞體飽滿，有突觸，透光度好，成透明狀；模型組細胞外形不規(guī)則，胞膜不完整，細胞碎裂，見大量碎片流出，細胞成圓形，無突觸，死細胞較多，被染成藍色；含藥血清組細胞形態(tài)相對較好，結(jié)構(gòu)比較清晰，胞體相對飽滿，僅有少量碎片，有突觸，少數(shù)被染成藍色。與正常對照組相比，模型組細胞成活率顯著降低，與模型組相比，含藥血清組細胞成活率顯著增高（見表1 及圖1）。

表1 各組細胞實驗結(jié)果(±s，n ＝3)Tab 1 Cell experiment results of each group (±s，n ＝3)

表1 各組細胞實驗結(jié)果(±s，n ＝3)Tab 1 Cell experiment results of each group (±s，n ＝3)

注（Note）：與正常對照組相比，*P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.01（Compared with the normal control group，*P ＜0.01；compared with the model group，#P ＜0.01）。

組別 活細GSDMD-N/β-actin正常對照組 95±3.61 37.46±0.40 33.99±0.92 0.41±0.09 0.37±0.06模型組 59±3.61* 45.63±1.04* 39.83±0.92* 1.31±0.21* 0.88±0.05*含藥血清組 87±2.65# 40.80±0.60# 36.46±0.62# 0.66±0.08# 0.48±0.06#

圖1 各組臺盼藍染色情況（200×）Fig 1 Trypan blue staining in each group（200×）

3.2 各組細胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量

與正常對照組相比，模型組上清液IL-1β和IL-18 的含量增多（P＜0.01）；與模型組相比，含藥血清組上清液IL-1β和IL-18 的含量下降（P＜0.01）。見表1。

3.3 各組細胞Caspase-1、GSDMD-N 蛋白表達的結(jié)果

與正常對照組相比，模型組Caspase-1 和GSDMD-N 的蛋白表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，含藥血清組Caspase-1 和GSDMD-N的蛋白表達顯著降低（P＜0.01）（見表1 及圖2）。

4 討論

AD 的發(fā)病率隨著社會發(fā)展明顯升高，其病理機制尚不明確，可能與Aβ沉積，Tau 蛋白過度磷酸化，神經(jīng)細胞自噬，焦亡，氧化應激等有關(guān)[15-16]，早期防治AD 已成為醫(yī)學界急需解決的問題。

圖2 各組細胞的Caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表達的情況Fig 2 Expression of Caspase-1 and GSDMD-N protein in each group A.正常對照組（normal control group）；B.模型組（model group）；C.含藥血清組（drug containing serum group）

細胞焦亡與AD 具有密切聯(lián)系，AD 發(fā)生時，其病理產(chǎn)物Aβ異常增多聚集，形成外在的老年斑，同時也激活炎性小體，引發(fā)焦亡相關(guān)通路[17-18]。Aβ作用于SH-SY5Y 細胞時，會激活NOD 樣受體中的NLRP1 受體蛋白，NLRP1 廣泛存在于大腦神經(jīng)元中[19-20]。NLRP1 與凋亡相關(guān)微粒蛋白（又稱接頭蛋白，ASC）和效應蛋白Caspase-1 前體（Pro-caspase-1）結(jié)合成多蛋白復合物NLRP1 炎性小體（inflammasome）[8]。炎性小體激活Pro-caspase-1 形成Caspase-1。Caspase-1把焦亡的執(zhí)行者GSDMD 裂解為GSDMD-C 端和GSDMD-N 端[21]。GSDMD-N 的出現(xiàn)可引發(fā)細胞焦亡，并在膜上形成孔隙，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)[22]，而Caspase-1 又可剪切細胞內(nèi)IL-1β和IL-18 的前體，使其生成IL-1β和IL-18 并釋放到細胞外，引起細胞炎性反應[23]。陳倢[24]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可調(diào)整機體細胞免疫炎性反應，調(diào)節(jié)學習記憶能力，從而改善AD 的狀態(tài)。六味地黃丸最早見于《小兒藥證直訣》，是補陰的經(jīng)典要方[25]。此方由6 味藥組成，3 味補藥，3 味瀉藥。補藥為熟地黃、山萸肉和山藥，此三藥相伍，可補益肝脾腎，即為三陰并補；瀉藥為澤瀉、牡丹皮和茯苓，均為佐藥。三補三瀉，以補為主。在中醫(yī)看來，AD 是由髓減腦消、腎精不足導致的，而六味地黃丸正是滋陰補腎、填精益髓的重要方劑。崔勇[13]研究認為六味地黃丸可有效抑制細胞炎性反應，進而改善AD。由此可知，六味地黃丸可能在抑制焦亡炎性反應上，發(fā)揮了重要作用（見圖3）。

圖3 炎性反應機制與含藥血清作用Fig 3 Mechanism of inflammatory response and the effect of drug containing serum

本實驗運用益腎填精的方法，探討六味地黃丸含藥血清對AD 細胞模型焦亡的影響。六味地黃丸含藥血清濃度篩選預實驗中，將血清稀釋成25%、50%和100% 3 個劑量組，根據(jù)CCK8 結(jié)果顯示，100%含藥血清組（增殖率97.72%）相比于25%（增殖率83.79%）、50%（增殖率87.60%）含藥血清組的細胞增殖率要明顯增高（P＜0.01），所以最終選擇了100%含藥血清組。臺盼藍結(jié)果顯示，模型組細胞成活率降低，而含藥血清組細胞成活率增高，提示六味地黃丸可以保持細胞膜的完整性，抑制細胞的死亡，與文獻報道一致[26]；Western blot 和ELISA 實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18 表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，含藥血清組Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18 表達均顯著降低（P＜0.01），提示六味地黃丸可抑制焦亡通路上的相關(guān)蛋白，對神經(jīng)細胞的焦亡具有明顯改善作用。李昕[7]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞焦亡時，主要病機在于人體的肝腎虧虛，運用填精益髓、補益肝腎的方法可改善此狀態(tài)。綜上可得，六味地黃丸可明顯降低焦亡相關(guān)通路上的蛋白，進而抑制免疫炎性反應，對AD起到了積極改善的作用，為今后AD 的治療研究提供依據(jù)。