染料木黃酮對乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

易佩佩，趙英琦，丁吉雪，陳文君，陳婉榕，王夢璇，呂元明（桂林醫學院公共衛生學院，廣西 桂林541000）

乳腺癌（breast cancer）是女性發病率最高的腫瘤，同時也是女性腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌的復發與轉移是導致患者死亡的主要原因，研究發現高達70%的淋巴結陽性和高達30%的淋巴結陰性乳腺癌會在治愈后復發[2]，而更嚴重的是腫瘤一旦發生轉移，中位生存期僅為2 ～3年，這是目前臨床治療面臨的一大難題。

染料木黃酮（genistein，GEN）是異黃酮類化合物，在豆莢類植物中廣泛存在，屬于植物雌激素的一種，具有抗氧化、保護心血管、預防骨質疏松、抗腫瘤等藥理作用，還可作為輔助化療藥發揮作用[3-4]。已有研究證明GEN 通過NF-κB和AKT 途徑抑制乳腺癌細胞增殖，還與乳腺癌中雌激素受體結合從而對相關炎癥基因產生影響[5]。上皮間質轉化（EMT）在癌癥中被廣泛研究，并被認為在侵襲、轉移、化療耐藥性和與癌細胞侵襲性有關的過程中起著至關重要的作用[6]，但GEN 在調節乳腺癌細胞EMT 過程方面的作用仍不清楚。因此本實驗從EMT 過程探究GEN 對兩種乳腺癌細胞生物學特性的影響及相關分子機制，探討GEN 抗乳腺癌的作用機制，為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 細胞與試藥

MCF-7 細胞和MDA-MB-231 細胞（American Type Culture Collection，ATCC）；GEN、CCK-8試劑盒（美國MCE）；DMEM 培養基、胎牛血清（美國Gibco）；線粒體膜電位與細胞凋亡檢測試劑盒（中國碧云天）；ECL 超靈敏化學發光檢測試劑盒（上海雅酶）；DMSO（美國Sigma）；4%多聚甲醛（美國Solarbio）；β-actin、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（北京中杉金橋）；Caspase 3、BAX、Bcl-XL、Bcl2（武 漢Proteintech）；E-鈣調蛋白（E-Cadherin）、Vimentin、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）（美 國CST）；Twist、MMP-2、MMP-9、Snail、Slug（英國ABcam）。

2 方法

2.1 細胞增殖實驗

取對數生長期細胞，以每孔200 μL（約含5000 個細胞）接種于96 孔板內，每組設置3 個復孔。次日，吸出孔內培養基，按組別分別加入100 μL 配好含0[對照組（control）]、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培養基，同時設置不含細胞及無任何處理的空白對照組。分別培養0、24、48、72 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于培養箱4 h 后在酶標儀450 nm 波長下檢測吸光度。

2.2 平板克隆形成實驗

取對數生長期細胞按每孔1000 個細胞接種于6 孔板，放入細胞培養箱。次日，按設定藥物濃度加入GEN，放于培養箱內培養12 ～15 d。棄掉舊培養基，1×PBS 緩沖液洗滌后4%多聚甲醛溶液固定20 min，1×PBS 緩沖液洗滌3 遍，每孔加入650 μL 結晶紫染色30 min，置于通風處晾干后拍照并對克隆形成數量進行統計。

2.3 細胞凋亡實驗

取對數生長期的乳腺癌細胞，以每孔1×105個接種于12 孔板中。細胞過夜貼壁后分別以含0（對照組）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培養基繼續培養48 h。使用線粒體膜電位與細胞凋亡檢測試劑盒染色，隨即在熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

2.4 細胞劃痕實驗

6 孔板內每孔接種乳腺癌細胞6×105個，培養至匯合度達到95%以上，用黃色槍頭沿孔中線劃一條線，1×PBS 緩沖液清洗2 遍。分別加入含0（對照組）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的DMEM 培養基（不含血清）2 mL，繼續培養。劃痕后0、24、48、72 h 定點顯微鏡拍照記錄，用Image J 軟件處理圖像并計算相對細胞遷移率。

2.5 Transwell 實驗

取對數生長期的細胞消化離心，用GEN 濃度分別為0（對照組）、12.5、25、50 μmol·L－1的含2%胎牛血清的DMEM 培養基重懸細胞。按藥物濃度梯度依次向各小室內對應加入含5×104個細胞的200 μL 細胞懸液，24 孔板孔內加入500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培養基。培養48 h后PBS 緩沖液輕柔洗滌2 次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，隨后結晶紫避光染色20 min，PBS緩沖液洗滌3 次，在倒置顯微鏡下任意選取3 ～5個視野拍照計數，重復實驗3 次。鋪膠小室實驗需提前將Matrigel 基質膠鋪于各個小室上室的聚碳酸酯膜上，其他操作與未鋪膠相同。

2.6 Western blot 蛋白質印跡法

3 個濃度組的GEN 處理乳腺癌細胞48 h 后。使用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度：10% SDS-PAGE 進行電泳分離并轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，放入對應一抗中4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜，二抗室溫孵育1 ～2 h 后TBST 洗膜4 次，發光機內發光，分析條帶灰度值，計算蛋白質相對含量。

2.7 統計學方法

采用SPSS Statistics 21.0 和GraphPad Prism 8 軟件對實驗數據進行統計學分析。定量數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度GEN 對乳腺癌細胞增殖能力的影響

CCK-8 實驗結果顯示，隨著GEN 濃度增加，乳腺癌細胞增殖能力隨之降低。平板克隆形成實驗結果顯示，隨著GEN 濃度增加，乳腺癌細胞MCF-7 及MDA-MB-231 的克隆形成能力逐步降低，見圖1。

圖1 不同濃度染料木黃酮對乳腺癌細胞增殖的影響（n ＝3）Fig 1 Effect of different concentrations of GEN on the proliferation of breast cancer cells（n ＝3）

3.2 不同濃度GEN 對乳腺癌細胞凋亡的影響

細胞經過不同濃度的GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理48 h 后，置于鏡下觀察結果。與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，發出強烈綠色熒光的凋亡細胞數量逐漸增加，而紅色熒光的活細胞也出現減弱或者呈現陰性，見圖2。

3.3 不同濃度GEN 對乳腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實驗結果如圖3 所示，與對照組相比，GEN 作用下乳腺癌細胞的愈合速度減低，特別在25、50 μmol·L－1濃度下愈合能力均有明顯的抑制（P＜0.01）。Transwell 未鋪膠及鋪膠小室實驗結果分別見圖4 和圖5：與對照組相比，GEN 處理組穿過小室的細胞數均有明顯減少，同時穿過小室的細胞數量與藥物濃度成反比（P＜0.01）。

3.4 不同濃度GEN 對乳腺癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖2 染料木黃酮對乳腺癌細胞凋亡的影響（×100）Fig 2 Effect of GEN on the apoptosis of breast cancer cells（×100）

圖3 染料木黃酮對乳腺癌細胞遷移能力的影響（×40）（n ＝3）Fig 3 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells（×40）（n ＝3）

圖4 Transwell（未鋪膠）小室實驗檢測染料木黃酮對乳腺癌細胞遷移能力的影響（×200）（n ＝3）Fig 4 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（without glue）（×200）（n ＝3）

圖5 Transwell（鋪膠）小室實驗檢測染料木黃酮對乳腺癌細胞遷移能力的影響（×200）（n ＝3）Fig 5 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（with glue）（×200）（n ＝3）

不同濃度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理乳腺癌細胞48 h，凋亡相關蛋白表達結果如圖6所示，隨著GEN 濃度增加，兩種細胞中Caspase 3、Cleaved-caspase 3、BAX 蛋白表達水平升高，Bcl2、Bcl-XL 蛋白表達水平降低，BAX/Bcl2 比例增加。

3.5 不同濃度GEN 對乳腺癌細胞侵襲遷移相關蛋白表達的影響

不 同 濃度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理乳腺癌細胞48 h 后，對其侵襲相關蛋白表達水平的影響。結果如圖7 所示，隨著GEN 的藥物濃度增加，E-Cadherin 表達升高，N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低（見圖7）。

4 討論

目前乳腺癌的臨床治療多采用手術配合放化療的綜合療法，但由于化療藥價高且副作用強，因此對不良反應少，來源廣泛、價格低廉又易于獲取的新型低毒高效藥物的開發研究仍是抗乳腺癌研究中的重點。流行病學數據研究發現高異黃酮的攝入可能會降低乳腺癌發生的風險[7-8]。GEN 作為一種天然的異黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，已有研究證明其在口腔癌[9]、結腸癌[10]、甲狀腺癌[11]等腫瘤細胞中具有一定的抑制作用。本課題組研究發現GEN 能夠抑制乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的增殖。

圖6 染料木黃酮對乳腺癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響（n ＝3）Fig 6 Effect of GEN on the expression of apoptosis-related proteins in breast cancer cells（n ＝3）

圖7 染料木黃酮對乳腺癌細胞侵襲轉移相關蛋白表達的影響（n＝3）Fig 7 Effect of GEN on the expression of invasion and metastasisrelated proteins proteins in breast cancer cells（n ＝3）

最新研究發現GEN 能夠通過Notch1/NF-κB/Slug/E-Cadherin 途徑逆轉上皮-間充質誘導結腸癌細胞凋亡[10]。乳腺癌死亡的主要原因就是局部復發與遠處轉移，因此乳腺癌的不易治愈與其浸潤性和轉移性密切相關，而EMT 是腫瘤侵襲遷移的重要驅動因素[12-13]。乳腺癌的EMT 過程中，作為細胞上皮表型的E-Cadherin 作用是維持細胞的形態和結構，上皮腫瘤細胞發生侵襲的前提就是E-Cadherin 丟失，因此其丟失是EMT 發生的生物標志物之一。當E-Cadherin 表達出現下調時，作為間質表型的N-Cadherin 表達會上調來與之達到平衡[14]。作為間質表型的波形蛋白（Vimentin），隨著遷移能力的增加而表達上升，也被用來標記EMT 的發生。我們發現GEN 能抑制乳腺癌細胞的侵襲與遷移能力，顯著促進上皮型蛋白標志物E-Cadherin 的表達，抑制間質型蛋白標志Vimentin、N-Cadherin 的表達。這提示GEN 能抑制腫瘤細胞EMT 的發展，從而減弱細胞的侵襲與遷移能力。

而EMT 的發生則與許多因子相關。基質金屬蛋白酶（MMP）可以直接或間接誘導EMT 的發生。MMP 能夠直接破壞細胞基底膜和細胞外基質成分，使惡性腫瘤細胞侵襲、轉移[15]。而發生EMT 的必要條件則是損傷因素造成上皮組織基底膜結構的降解。此外，鋅指蛋白轉錄因子（Snail、Slug）、bHLH 轉錄家族（E12、E47 及Twist）和ZEB 轉錄因子（ZEB1 和ZEB2）[16]也可以調控EMT 的發生。E-Cadherin 啟動子區域元 件E-box 可與轉 錄因 子Snail、Slug 和Twist 相結合，抑制E-Cadherin 的轉錄，從而導致EMT的發生。Western blot 實驗結果顯示乳腺癌細胞加GEN處理后，MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail 和Slug 的表達減少。由此可見，GEN 可能通過調控MMP、鋅指蛋白轉錄因子、Twis 轉錄因子對EMT 過程發揮抑制作用。

綜上所述，本文首次提出來GEN 通過逆轉EMT 過程抑制乳腺癌細胞MCF-7 和MDAMB-231 的遷移和侵襲，誘導凋亡，且MMP、鋅指蛋白轉錄因子、Twis 轉錄因子在此過程中發揮了重要作用，為進一步明確GEN 這類植物雌激素對惡性腫瘤的影響提供了新的線索。但關于GEN 調控 EMT 過程的相關作用機制還有待后續深入研究，以期為乳腺癌的早期診斷與治療提供更多的可能。