一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定小兒黃龍顆粒中5種木脂素成分

劉晶，游龍?zhí)虊?mèng)如，張志勤，白杰，姚宇，吳慧敏，倪健（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

小兒黃龍顆粒是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的一款治療注意缺陷與多動(dòng)障礙（attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD）的中藥復(fù)方顆粒。它由熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠(yuǎn)志及桔梗11 味中藥組成。而目前關(guān)于小兒黃龍顆粒的研究?jī)H限于臨床試驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)[1-10]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥物作用機(jī)制領(lǐng)域還有待開發(fā)。現(xiàn)已有研究將五味子中的木脂素類成分用于ADHD 的治療[11]，同時(shí)這類成分被證明對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并能改善患者認(rèn)知能力和記憶能力[12]，所以具有較高的單獨(dú)研究?jī)r(jià)值。而小兒黃龍顆粒作為上市藥品已在臨床試驗(yàn)中證明其對(duì)于ADHD 的療效，故本試驗(yàn)選取這5 個(gè)含量相對(duì)較高、且有研究證明其神經(jīng)保護(hù)性的木脂素類成分建立含量測(cè)定方法。并選擇容易獲取，價(jià)格相對(duì)低廉的五味子醇甲作為內(nèi)參物，建立同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙5 種成分的一測(cè)多評(píng)法（QAMS），實(shí)現(xiàn)該藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)的進(jìn)一步延展。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津）；KQ5200DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Sartorius BT 125D 電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；G20 型高速醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海振捷實(shí)驗(yàn)有限公司）。乙腈、甲醇（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；正己烷、甲醇（分析純，天津市大茂化工廠）；磷酸（分析純，北京化工廠）；小兒黃龍顆粒（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：190701）；對(duì)照品五味子醇甲（批號(hào)：Y13D8H5095）、戈米辛D（批號(hào)：M05J9S65019）、五味子醇乙（批號(hào)：P4N10F103016）、當(dāng)歸酰基戈米辛H（批號(hào)：P17J9F65870）、五味子酯乙（批號(hào)：P07M6S1）（上海源葉生物科技有限公司，HPLC ≥98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-乙腈（2∶1）（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～30 min，50%→65%A；30 ～58 min，65%～70%A）流速0.8 mL·min－1，柱溫40℃，波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取一定量的五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙對(duì)照品，制成質(zhì)量濃度為137.68、19.20、43.20、29.72、8.64 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取小兒黃龍顆粒1 g，用5 mL 純凈水振搖溶解，再加入50 mL 正己烷，充分?jǐn)嚢韬蟪曁崛?0 min（超聲功率200 W，40 Hz），用正己烷補(bǔ)足失重，6000 r·min－1，離心10 min，取上層澄清溶液放入雞心瓶?jī)?nèi)，40 ℃減壓濃縮至干，用甲醇復(fù)溶定容至10 mL 量瓶中。溶液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

圖1 小兒黃龍顆粒樣品的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Xiaoer Huanglong granule

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（μg·mL－1），峰面積為縱坐標(biāo)Y，求得線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 5 種木脂素成分的線性關(guān)系考察Tab 1 Linear relation of 5 lignans

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙峰面積RSD值分別為0.070%、0.30%、0.060%、0.43%、0.20%，出峰時(shí)間的RSD值分別為0.32%、0.24%、0.19%、0.12%、0.070%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品溶液（批號(hào)：190701），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h進(jìn)樣。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙峰面積RSD值分別為2.7%、2.4%、2.0%、3.5%、1.5%，出峰時(shí)間的RSD值分別為0.35%、0.32%、0.30%、0.21%、0.23%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：190701）小兒黃龍顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份樣品，分別精密吸取10 μL 進(jìn)樣。測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量的RSD值分別為2.3%、1.9%、2.2%、2.6%、0.82%。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：190701）小兒黃龍顆粒（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙含量分別為0.215、0.028、0.056、0.038、0.021 mg），再加入含量相近的5 種對(duì)照品（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙含量為0.219、0.029、0.057、0.038、0.021 mg），按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份樣品，分別精密吸取10 μL 進(jìn)樣。測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均回收率為96.7%、102.2%、95.9%、100.5%、102.9%，其RSD值分別為3.6%、2.8%、2.9%、1.7%、3.7%。

2.5 相對(duì)校正因子的計(jì)算

根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式：fi/s＝fi/fs＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），以多點(diǎn)校正法進(jìn)行計(jì)算。選定五味子醇甲為內(nèi)參物，則fi、Ci、Ai分別為五味子醇甲的相對(duì)校正因子、濃度及峰面積，而fs、Cs及As則為待測(cè)成分的校正因子、濃度及峰面積，同時(shí)選取“2.4.1”項(xiàng)下線性系列濃度與峰面積進(jìn)行計(jì)算。可得戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的校正因子為1.414、1.094、0.926、1.031，RSD值分別為1.4%、0.69%、2.9%、2.5%。

2.6 QAMS 系統(tǒng)耐用性考察

2.6.1 波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響 分別考察檢測(cè)波長(zhǎng)252、254、256 nm 對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對(duì)校正因子平均值分別為1.398、1.088、0.939、1.030，RSD值分別為1.9%、0.98%、3.0%，1.9%。表明波長(zhǎng)對(duì)戈米辛D、五味子醇乙、五味子酯乙的相對(duì)校正因子無(wú)影響，相較之下對(duì)當(dāng)歸酰基戈米辛H 會(huì)產(chǎn)生一定影響。

2.6.2 柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 分別考察柱溫30、35、40℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對(duì)校正因子平均值分別為1.405、1.093、0.940、1.042，RSD值分別為0.68%、0.080%、1.5%、0.91%，表明溫度對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)影響。

2.6.3 流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 分別考察0.7、0.8、0.9 mL·min－1流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對(duì)校正因子平均值分別為1.413、1.095、0.939、1.042，RSD值分別為0.21%、0.11%、1.2%、0.86%，表明流速對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)影響。

2.6.4 色譜柱對(duì)校正因子的影響 分別考察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 種型號(hào)色譜柱對(duì)戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對(duì)校正因子的影響。測(cè)得其平均值分別為1.414、1.096、0.945、1.045，RSD值分別為0.54%、0.19%、1.4%、0.88%，表明色譜柱的型號(hào)對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)影響。

2.7 待測(cè)組分色譜峰定位

采用比較相對(duì)保留時(shí)間（以五味子醇甲為內(nèi)參物）的方法對(duì)5 種木脂素成分進(jìn)行定位，分別考 察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 種型號(hào)色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，測(cè)得戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙的相對(duì)保留時(shí)間的平均值分別為1.154、1.277、1.456、1.911，RSD值則分別為4.2%、4.0%、2.3%、4.4%。

2.8 QAMS 與外標(biāo)法結(jié)果的比較

外標(biāo)法測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量為0.325、0.042、0.085、0.057、0.031 mg·g－1，QAMS 測(cè)得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量分別為0.325、0.042、0.084、0.057、0.031 mg·g－1，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＝0.156，結(jié)果無(wú)顯著性差異，顯示QAMS 準(zhǔn)確可行。具體結(jié)果見表2。

表2 一測(cè)多評(píng)與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較Tab 2 QAMS method compared with the external standard method

3 討論

在條件摸索時(shí)發(fā)現(xiàn)常規(guī)的有機(jī)相甲醇或乙腈溶液在本試驗(yàn)中分別會(huì)導(dǎo)致色譜峰分離度差和拖尾嚴(yán)重，故采取抽濾超聲混合后甲醇、乙腈比例為 2∶1 的溶液作為有機(jī)相。酸度較低的水相則存在色譜峰分離度較差的問(wèn)題，對(duì)比了0.3%、0.5%、1%甲酸水溶液，0.1%醋酸水溶液和0.1%、0.2%磷酸水溶液的譜圖，最終選取了0.2%磷酸水溶液作為水相。提取溶劑對(duì)比了70%、80%乙醇，甲醇和正己烷的效果，發(fā)現(xiàn)除了正己烷，采用其他溶劑提取后都會(huì)在5 min 之前出現(xiàn)大的雜峰，故選取了正己烷作為提取溶劑。考察有機(jī)相的初始濃度為40%、45%、50%、55%、60%時(shí)發(fā)現(xiàn)50%的初始濃度可以讓成分分離達(dá)到最佳效果。在前處理?xiàng)l件上比較了超聲時(shí)間為30、45、60、120 min 的提取效果，其中60 min 為最優(yōu)提取時(shí)間；考察了210、220、230、244、250、254、260、270、280、290、334 nm 波長(zhǎng)下的譜圖，綜合考慮分離度和峰面積選取了254 nm 為波長(zhǎng)條件；考察了25、50、100 倍提取溶劑的提取效果，確定50 倍即可提取完全；柱溫的高低對(duì)分離度有所影響，在考察了30、35、40 ℃后，選取了40℃作為最終柱溫條件；而高速離心和過(guò)濾都能達(dá)到除去雜質(zhì)的效果，但離心更簡(jiǎn)便且在操作中過(guò)程中易于保證操作一致性，故選取高速離心進(jìn)行除雜；同步考察色譜時(shí)間（50 ～100 min）和流速（0.35 ～1.0 mL·min－1）對(duì)綜合效率和分離度的影響，最終選取了58 min 和0.8 mL·min－1作為色譜時(shí)間和流速。

在考察中發(fā)現(xiàn)提取容器的大小和種類并不會(huì)對(duì)提取率產(chǎn)生影響。由于五味子醇甲以外的4 種成分含量很低，在加樣回收試驗(yàn)中出現(xiàn)直接加入微量對(duì)照品誤差較大的問(wèn)題，且甲醇和正己烷溶液直接混勻在攪拌和超聲的過(guò)程中易出現(xiàn)渾濁影響提取率，所以，先配制和樣品成分含量近似相等的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，旋干后在同一容器中加入樣品以制備加樣回收試驗(yàn)的供試品溶液。在進(jìn)行QAMS 系統(tǒng)耐用性考察時(shí)，參考文獻(xiàn)[13]和2020年版《中國(guó)藥典》四部[14]中分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，選取了較小的試驗(yàn)條件變動(dòng)范圍。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中，通過(guò)退行性造模大鼠的行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)五味子醇甲可能通過(guò)抗氧化作用改善治療阿爾茨海默病的癥狀[15]；采取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和阿爾茨海默病模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)包含五味子醇甲、戈米辛D 及當(dāng)歸酰基戈米辛H 在內(nèi)的8 種成分為生脈散中主要起神經(jīng)保護(hù)作用的質(zhì)量標(biāo)志物成分[16]。另一項(xiàng)采取液質(zhì)聯(lián)用鑒定技術(shù)和抑郁癥模型小鼠的研究則發(fā)現(xiàn)，五味子醇提物中包括五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯乙在內(nèi)的14 種木脂素類成分可以上調(diào)與神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)的BDNF、TrkB、CREB 信號(hào)通路[17]。所以從藥理機(jī)制上推測(cè)，本研究中涉及到的這5 個(gè)成分有可能在小兒黃龍顆粒治療ADHD 的過(guò)程中起到一定作用，因此，建立一套完整的多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法具有研究意義。在提高本方法實(shí)用性方面，考慮到當(dāng)歸酰基戈米辛H 和戈米辛D 對(duì)照品價(jià)格較貴，難以獲取，故采用價(jià)格低廉的常見對(duì)照品五味子醇甲作為內(nèi)參物，建立了QAMS 同時(shí)測(cè)定5 個(gè)成分的含量，填補(bǔ)了小兒黃龍顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白。