不同肺轉移潛能的大鼠肝癌細胞外泌體對巨噬細胞轉錄組的影響*

羅偉鑫，劉超群，許磊波，劉 超，吳文睿

肝癌易發生治療后復發和遠處腫瘤轉移[1,2]，其中肺部是最常見的肝外轉移部位[3,4]。研究表明，腫瘤微環境是影響腫瘤轉移的重要因素，其中巨噬細胞是肝癌腫瘤微環境中浸潤數量最多的免疫細胞之一，在腫瘤的發生發展和轉移過程中起重要作用[5,6]。外泌體(exosomes)是細胞分泌至胞外的、納米級大小的囊泡狀小體，其中含有蛋白質、脂質、非編碼RNA等多種物質，在胞間的物質和信息交流中發揮重要作用[7]。近年來，體內外研究證據表明肝癌細胞來源的外泌體通過多種機制對原發腫瘤組織和轉移灶內腫瘤微環境進行調控，促進肝癌細胞發生轉移[8,9]。關于肝癌通過外泌體影響巨噬細胞功能促進肺轉移的報道較少。本研究采用轉錄組測序方法(transcriptome sequencing)比較了大鼠骨髓來源的巨噬細胞在經兩株不同肺轉移潛能的肝癌細胞(WB-F344-Notch1high[10]和WB-F344-Bmi1high[11])來源外泌體處理后轉錄譜的差異，解析差異基因的功能，為探究肝癌通過外泌體馴化巨噬細胞促進肝癌肺轉移的分子機制提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑與儀器 大鼠成體肝干細胞WB-F344購自中科院上海細胞庫，WB-F344-Notch1high (WN1)和WB-F344-Bmi1high(WB1)細胞株由我們課題組前期通過慢病毒轉染方式在WB-F344細胞中分別過表達Notch1和Bmi1，并參考Hooth MJ et al的選擇性培養方法構建而成[12]。雄性F344大鼠，大于8周齡(成年大鼠)，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。高糖DMEM(BI)；胎牛血清(Gibco)；青霉素/鏈霉素混合試劑(BI)；PBS(BI)；紅細胞裂解液(白鯊易)；大鼠M-CSF細胞因子(PeproTech)；通用型RNA提取裂解液(TAKARA)；蛋白酶抑制劑(康為世紀)；磷酸酶抑制劑(康為世紀)；RIPA(康為世紀)；BCA法蛋白定量分析試劑盒(Invitrogen)；上樣緩沖液(loading buffer，弗德生物)；ECL發光液(弗德生物)；PKH26(Sigma)；DAPI(索萊寶)；抗CD9抗體(Abcam)；抗CD81抗體(Santa Cruz)；抗TSG101抗體(Abcam)；抗Calnexin抗體(Affinity)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G(CST)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ig G(CST)；細胞培養箱(BINDER)；臺式離心機(湘儀L530)；超高速離心機(Beckman Optima XE-100)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 800)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；NanoSight NS300(Malvern Panalytical)；透射電子顯微鏡(JEM-1400)。

1.2 細胞培養 取WB1和WN1兩株細胞，用完全培養基(含有100 IU/m L青霉素G、100 mg/m L鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM)在5%CO2、37℃培養箱中培養，收集外泌體時，更換為無外泌體完全培養基培養。

1.3 大鼠骨髓來源的巨噬細胞的提取和培養 使用異氟烷將成年F344大鼠麻醉，用頸椎脫臼法處死，用75%酒精消毒全身毛發和皮膚，在無菌條件下取出股骨和脛骨。在安全柜中使用無菌器械剔除其表面軟組織，剪斷兩端骨垢端，暴露骨髓腔，使用無菌PBS反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，500 g離心5 min。棄上清，使用紅細胞裂解液常溫裂解5 min，再次500 g離心5 min，棄上清，用含M-CSF(20 ng/mL)的完全培養基(含有100 IU/m L青霉素G，100 mg/m L鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM)重懸細胞、鋪板，在5%CO2的37℃培養箱中培養，每2 d更換1次含M-CSF(20 ng/mL)的新鮮培養基，7 d后獲得大鼠骨髓來源的巨噬細胞。

1.4 外泌體獲取和實驗分組 待WN1和WB1細胞在培養皿中長至約60%～70%密度后，更換去除外泌體的完全培養基繼續培養48 h，分別收集WN1和WB1細胞培養上清，采用差速離心法從細胞上清中提取外泌體：全部離心步驟都在4℃條件下進行，首先2000 g離心20 min，去除細胞及其碎片。12000 g離心30 min，進一步去除細胞碎片。在超高速離心機上以110000 g離心70 min，保留沉淀并用適量PBS重懸，再次以110000 g離心70 min，最后得到的外泌體沉淀用PBS 100 μL重懸，并轉移至EP管中備用。取等量的WB1和WN1細胞外泌體，分別處理大鼠骨髓來源的巨噬細胞48 h，使用RNA提取裂解液收集RNA樣品送測序，其中WN1組為實驗組，WB1組為對照組，實驗重復3次，對每次結果進行配對分析。

1.5 WB1和WN1細胞及其外泌體蛋白檢測 采用Western blot法，使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA溶液冰上裂解細胞或者外泌體15 min，收集裂解液，4℃，20000 g離心30 min，獲取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer混勻，100℃金屬浴加熱10 min，冰上放置冷卻、上樣。蛋白電泳后轉移至PVDF膜上，加封閉液室溫下封閉1 h。加入一抗，置搖床上，4℃孵育過夜。用1×TBST洗滌3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min。ECL法顯色， 使用MiniChemi化學發光快速拍攝系統獲取圖像。一抗的使用濃度分別為抗CD9(1: 1000)、抗CD81(1: 500)、抗TSG101(1: 2000)、抗Calnexin(1: 1000)。

1.6 外泌體粒徑檢測 獲得外泌體懸液，調整外泌體至符合測量要求的濃度，使用NanoSight NS300檢測外泌體粒徑大小，同一樣品重復檢測3次。

1.7 外泌體鑒定 取外泌體懸液10μL，滴加到電鏡銅網，室溫靜置沉淀5 min，用濾紙吸去液體。吸取醋酸鈾10μL，滴加到銅網沉淀2 min，用濾紙吸去多余液體。室溫靜置、晾干后，使用JEM-1400透射電鏡觀察并拍攝。

1.8 外泌體體外攝取實驗 使用PKH26對外泌體染色。將標記的外泌體加入巨噬細胞培養體系中繼續培養12 h，固定，并用DAPI染細胞核，在激光共聚焦顯微鏡下對攝取外泌體的巨噬細胞進行拍攝。

1.9 轉錄組測序與數據分析 建立轉錄組文庫和測序流程由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。以TRIzol法提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度和純度，并使用Agilent 2100生物分析儀評估RNA完整性。確定樣品符合要求后，使用TruSeq鏈式mRNA LT樣品制備試劑盒構建文庫并在Illumina HiSeq X Ten平臺上進行測序。所得fastq格式的raw data先用Trimmomatic 處理，去除低質量的數據，獲得clean data后，使用hisat2比對到大鼠的參考基因組，獲得對應轉錄數據。最后，通過htseq-count軟件獲取各基因的reads數，使用DEseq2包[13](1.28.1版本)對實驗組和對照組進行配對樣本的差異表達分析, 將log2(差異倍數) ≥ 1且P<0.05的基因定義為具有顯著統計學意義的差異基因。獲得差異基因后，使用ggplot2包[14](3.3.2版本)和pheatmap包(1.0.12版本)繪制火山圖和熱圖。

1.10 通路和功能的富集分析 使用Clusterprofiler包[15](3.16.0版本)，采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)數據庫對差異表達基因進行信號通路注釋和富集分析；采用基因本體論(gene ontology, GO)數據庫對差異表達基因進行生物學過程(biological process, BP)、細胞組分)cellular component, CC)、分子功能 (molecular function, MF)方面的富集分析，校準P值(p.adjust)<0.05定義為統計學差異顯著。

1.11 蛋白相互作用網絡分析 利用相互作用基因檢索搜尋工具(search tool for the retrieval of interacting genes, STRING)數據庫分析差異基因中mRNA編碼的蛋白之間的相互作用，并使用Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網絡(PPI)，使用cytoHubba插件根據Degree分數大小篩選排位前10位的核心基因和使用MCODE插件篩選核心子網絡，確定處于相互作用網絡核心區域的差異基因。

2 結果

2.1 WB1和WN1來源的外泌體的鑒定 外泌體的標志性蛋白CD9、CD81和TSG101可以在WB1和WN1細胞及其來源的外泌體中被檢測到。內質網相關蛋白Calnexin只能在細胞中被檢測到，而在外泌體中沒有表達。我們使用分步差速離心法所獲得的外泌體的粒徑大小較為均一，主要分布在50～150 nm范圍內，兩株細胞外泌體粒徑大小分布差別不大(圖1A、B)。進一步的電鏡檢測也證明了我們所獲得的囊泡懸液為外泌體，其直徑大小符合一般外泌體的定義(圖1C)。

圖1 外泌體鑒定

2.2 大鼠骨髓來源的巨噬細胞能夠攝取外泌體并且在外泌體刺激后形態發生明顯變化 通過PKH26對外泌體進行標記并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果顯示在體外培養條件下，大鼠骨髓來源的巨噬細胞可以攝取加入培養體系的外泌體(圖2A，紅色顆粒物為外泌體)。光鏡下觀察顯示，大鼠骨髓來源的巨噬細胞在接受外泌體刺激前形態多為長梭狀，突觸較長；接受外泌體刺激48 h后，大部分巨噬細胞形態變成煎蛋狀(圖2B)。

圖2 巨噬細胞攝取外泌體及其形態變化

圖3 WN1和WB1外泌體刺激的巨噬細胞轉錄組差異分析結果火山圖和熱圖

2.3 WN1和WB1外泌體刺激的巨噬細胞轉錄組差異基因分析 對分別接受WB1或WN1來源的外泌體處理的大鼠骨髓巨噬細胞的轉錄組測序數據進行差異分析，構建火山圖。以log2(差異倍數)≥1且P值<0.05為閾值進行篩選，共發現318個差異表達基因(圖3A)。與WB1組比，WN1來源的外泌體處理的巨噬細胞上調的基因有296個(紅色標注散點)，下調的基因有22個(綠色標注散點)。我們以熱圖形式對差異基因進行了展示(圖3B)。

2.4 WN1外泌體刺激的巨噬細胞上調差異基因的KEGG通路富集分析 對2.3中差異分析所得到的296個上調差異基因進行KEGG通路富集分析，結果共有19條通路被富集，對分析所得統計值顯著性排名前10的通路進行了展示，分別是細胞因子-細胞因子受體的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Rap1 信號通路(Rap1 signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、黏著斑(focal adhesion)、鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用(viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)和類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，圖4A)。接著，我們對顯著性排名前5的富集通路共有基因進行分析，發現Cxcl6、Il6、Cxcl2、Ccl12、Ccl20和Cxcl3等基因至少在3個富集通路中存在(圖4B)。

圖4 WN1外泌體刺激的巨噬細胞轉錄組上調差異基因KEGG分析結果

圖5 WN1外泌體刺激的巨噬細胞轉錄組上調差異基因GO分析結果

2.5 WN1外泌體刺激的巨噬細胞上調差異基因的GO功能富集分析 由于GO條目存在冗余，在對2.3中差異分析所得296個上調差異基因進行GO功能富集分析后，我們挑選其中具有代表性的功能條目進行展示。結果顯示在細胞組分(cellular component，CC)方面，差異基因主要集中分布在細胞外基質(extracellular matrix)、細胞頂端部分(apical part of cell)、細胞間連接(cell-cell junction)、收縮纖維(contractile fiber)等和細胞黏著和運動相關的條目中(圖5A)；在分子功能(molecular function, MF)方面，差異基因主要集中在受體調節器活動(receptor regulator activity)、G蛋白-偶聯受體結合(G protein-coupled receptor binding)、生長因子活性(growth factor activity)、糖胺聚糖結合(glycosaminoglycan binding)、金屬肽酶活動(metallopeptidase activity)等與細胞間信息交流和細胞外基質調控相關的條目中(圖5B)；在生物過程(biological process, BP)方面，差異基因主要集中在血管形成(angiogenesis)、上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、上皮細胞遷移(epithelial cell migration)、上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition)等與腫瘤生長和轉移相關的條目中(圖5C)。

圖6 WN1外泌體刺激的巨噬細胞轉錄組差異基因蛋白質相互作用網絡分析結果

2.6 蛋白質相互作用網絡分析篩選WN1外泌體刺激的巨噬細胞差異基因中的核心基因 在STRING數據庫輸入2.3中差異分析所得318個差異基因后，獲得307個節點，655條邊緣的PPI網絡，為了簡化PPI網絡尋找核心基因，通過Cytoscape軟件的cytoHubba插件得到Degree分數排名前10的基因(圖6A)，分別是Vegfa、Il6、Thbs1、Col1a2、Mmp3、Mmp2、Edn1、Postn、Bgn和Lpar1。另外，我們還通過MCODE插件對重要的核心網絡進行篩選排名前2位的核心子網絡(圖6B)，我們發現Vegfa、Il6、Edn1和Lpar1這4個基因在MCODE核心子網絡中也占據有重要的地位。

3 討論

肝癌肺轉移是影響肝癌患者預后的重要因素，其發生機制值得深入探討。既往研究證明肝癌可以通過分泌外泌體作用于腫瘤相關成纖維細胞[16]或內皮細胞[17]，促進肝癌實現肺轉移。內質網應激可促使肝癌細胞分泌富含miR-23a-3p的外泌體作用于巨噬細胞，增加巨噬細胞PD-L1的表達，實現腫瘤免疫逃逸[18]。本研究通過轉錄組測序技術和生物信息學分析，對不同肺轉移潛能的大鼠肝癌細胞來源外泌體處理的骨髓來源巨噬細胞進行對比及KEGG和GO分析，進一步探討了差異基因可能參與的信號通路和生物學過程。

肝癌微環境中的巨噬細胞在腫瘤的誘導下可以分泌多種細胞因子、趨化因子或生長因子作用于腫瘤細胞、腫瘤相關間質細胞或內皮細胞，促進腫瘤細胞EMT、誘導腫瘤內血管新生、淋巴管新生和免疫抑制等過程，進而促進腫瘤的發展和轉移[19,20]。在多種腫瘤模型，Vegfa被報道具有通過促進血管生成和增加血管通透性促進腫瘤發展和轉移的功能[21,22]。Il6作為重要的促炎因子，在多種腫瘤中被證實具有促進腫瘤細胞EMT，進而增強其向遠處轉移能力[23,24]。Mmp2和Mmp3等金屬蛋白酶則是促進細胞外基質降解的重要參與者，可以幫助腫瘤細胞向外侵出原發灶，實現遠處轉移[25]。