慢加急性肝衰竭小鼠肝組織組蛋白去乙酰化酶mRNA水平變化*

林列坤，盧春生，周應(yīng)生，鄭 義，楊菊紅，鄒繼彬，張仁超，梁旭競

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)是機(jī)體組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)的重要組成部分，乙酰化修飾是目前抗炎治療研究的新方向[1-3]。HDAC抑制劑被廣泛應(yīng)用于抗炎治療[4-7]。本文采用D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)聯(lián)合誘導(dǎo)建立小鼠慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)模型[8]，觀察了HDAC抑制劑干預(yù)對(duì)小鼠肝組織HDAC mRNA水平的影響，以探討HDAC在ACLF發(fā)病過程中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器與引物 4周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠28只，由武漢云克隆動(dòng)物有限公司提供【動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2015-0091，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：42816300001640】，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。遵循3R原則使用動(dòng)物，并經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)(IACUC)審核批準(zhǔn)(編號(hào)為：IACU18-0077)； 檢測血生化試劑由南京建成生物公司提供；美國Thermo提供RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為#K1622(第一鏈cDNA合成試劑)，Roche提供FastStart Universal SYBR Green Master為04913914001(qPCR 染料)及其他一些提取RNA和RNA轉(zhuǎn)錄試劑；美國Omni 牌Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質(zhì)儀；北京DragonLab D3024R臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)；美國ABI 7300熒光定量PCR儀。病理學(xué)檢測儀器由浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司提供；qPCR各種引物名稱及其序列見表1。

1.2 動(dòng)物模型的建立 隨機(jī)將動(dòng)物分為7組，每組4只。A組：對(duì)照組；B組：模型組；C組：曲古抑菌素 A(trichostatin A，TSA)處理組(0.5 mg.kg-1)；D組：大劑量正丁酸鈉處理組(2000 mg.kg-1)；E組：小劑量正丁酸鈉處理組(500 mg.kg-1)；F組：大劑量NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbarmate, PDTC)處理組(200 mg.kg-1)；G組：小劑量PDTC處理組(50 mg.kg-1)。除A組外，給予其他組小鼠20%CCL4油溶液5 ml.kg-1腹腔注射，2次/w，連續(xù)注射12 w，構(gòu)建慢性肝功能受損小鼠模型。在12 w末，給予不同藥物處理組小鼠藥物經(jīng)尾靜脈注射，給予A組和B組注射等體積的生理鹽水。在藥物干預(yù)3 d后，給予D-Gal 1 g.kg-1和LPS 10 μg.kg-1腹腔注射，誘發(fā)急性肝衰竭，完成構(gòu)建ACLF小鼠模型。給予各組模型小鼠戊巴比妥注射麻醉，無菌取血和肝臟。取肝組織，經(jīng)固定、脫水、包埋后，制作石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3 肝組織HDAC mRNA水平檢測 采用熒光定量PCR法，取肝組織100 mg，在勻漿器中研磨，得到RNA，加入無RNA酶水15μl溶解RNA，使其終濃度為200 ng/μl。加入RNA溶液2 μg，反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管： 2× qPCR Mix 12.5μl，7.5μM基因引物2.0μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl， ddH2O 8.0μl。95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，循環(huán)40次；再75℃～95℃，每20 s升溫1℃。以ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)， K=A-B ，表達(dá)倍數(shù)=2-K。

表1 qPCR各種引物名稱及其序列

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清AST、ALT和TBIL水平比較 B組血清AST、ALT和TBIL水平顯著高于A組(P<0.05)，不同HDAC抑制劑干預(yù)組血清AST、ALT和TBIL水平顯著低于B組(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血生化比較

2.2 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) A組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈條索狀排列，細(xì)胞無腫脹，匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤；B組表現(xiàn)為肝細(xì)胞體積增大，呈彌漫性濁腫，匯管區(qū)見融合性壞死，小葉周邊充血和炎細(xì)胞浸潤；C組/D組/E組/F組/G組：肝細(xì)胞體積稍增大，輕度濁腫，匯管區(qū)見片狀或碎片狀壞死，少量炎細(xì)胞浸潤(圖1)。

2.3 各組小鼠肝組織Ⅰ類HDAC mRNA水平變化 四種HDAC水平一致，B組較A組顯著上升，而C、D、E、F和G組較B組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.4 各組小鼠肝臟組織Ⅱ類HDAC mRNA擴(kuò)增倍數(shù) 除DHAC4和DHAC10外，其他四種HDAC表現(xiàn)一致，B組較A組顯著上升， C、D、E、F、G組比B組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，200×)

表3 各組小鼠肝組織Ⅰ類HDAC mRNA水平比較

表4 各組小鼠肝組織Ⅱ類HDAC mRNA水平比較

3 討論

HDAC是機(jī)體組蛋白乙酰化水平調(diào)節(jié)的兩大組成之一，它與組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HAT)蛋白結(jié)構(gòu)和酶活性保持高度的平衡[9-11], 稱為“乙酰化動(dòng)態(tài)平衡”，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和平衡有重要的作用[12-15]。文獻(xiàn)報(bào)道，在疾病發(fā)生時(shí)，組蛋白乙酰化平衡被打破，HDAC活性或含量升高[16]。本課題按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立小鼠慢性肝損傷模型，然后給予不同劑量的HDAC抑制劑作為乙酰化調(diào)控藥物干預(yù)模型小鼠，再建立小鼠ACLF模型[8]。檢測小鼠肝臟組織Ⅰ類和Ⅱ類HDAC mRNA水平，從而明確HDAC在肝衰竭乙酰化調(diào)控過程中的作用。HDACs共有18個(gè)成員，包括兩大家族，可分為四類[17]。本課題以常見的Ⅰ類和Ⅱ類HDAC為研究內(nèi)容。

本研究證明HDAC抑制劑的應(yīng)用保護(hù)了肝衰竭動(dòng)物，改善了肝組織學(xué)損傷[18]，再次印證了乙酰化調(diào)控能有效保護(hù)肝衰竭。急性肝衰竭動(dòng)物肝組織HDAC mRNA水平顯著上升，在乙酰化干預(yù)后，各干預(yù)組肝組織HDAC mRNA水平顯著性下降，與相關(guān)研究結(jié)論一致。

HDAC代表機(jī)體去乙酰化作用。肝衰竭時(shí)肝組織HDAC表達(dá)上升，機(jī)體去乙酰化作用增強(qiáng)。如果乙酰化調(diào)控平衡被破壞，使用HDAC抑制劑干預(yù)后，肝組織HDAC表達(dá)大幅度下降，機(jī)體去乙酰化作用減弱，乙酰化作用增強(qiáng)，被破壞失衡的乙酰化動(dòng)態(tài)平衡被調(diào)控，再次趨向平衡，這個(gè)過程能有效保護(hù)肝衰竭動(dòng)物。由此可見，HDACs對(duì)ACLF有促進(jìn)作用，而HDAC抑制劑對(duì)ACLF則具有保護(hù)作用。HDAC mRNA是應(yīng)用乙酰化調(diào)節(jié)治療肝衰竭時(shí)HDAC轉(zhuǎn)化表達(dá)的重要指標(biāo)，代表肝臟的去乙酰化作用，HDAC mRNA水平越低，表示HDAC表達(dá)越低，提示乙酰化調(diào)節(jié)干預(yù)肝衰竭越有效。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，雖然肝衰竭動(dòng)物肝組織Ⅰ類和Ⅱ類HDAC mRNA變化明顯，但也不是所有的HDAC mRNA均參與了肝臟的乙酰化調(diào)控。在Ⅱ類HDAC中，HDAC4和HDAC10 mRNA水平在干預(yù)前后改變不明顯，可能意味著其在肝臟乙酰化調(diào)控中作用不大。所以，我們可以發(fā)現(xiàn)，不是所有的Ⅰ類和Ⅱ類HDAC都參與了肝臟的乙酰化調(diào)控，各種HDAC的具體功能還有待進(jìn)一步細(xì)化。在本實(shí)驗(yàn)D組較E組或F組較G組均使用種類相同而大劑量的HDAC抑制劑，但HDAC mRNA水平未見明顯變化。我們認(rèn)為肝臟啟動(dòng)乙酰化調(diào)控是一種特殊的模式，與外加干預(yù)的抑制劑種類有關(guān)，而與抑制劑的濃度關(guān)系不大。

在真核細(xì)胞中，乙酰化修飾是最常見的共價(jià)修飾，其作用譜廣泛，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的修飾作用，目前應(yīng)用最廣泛的為抗炎治療的應(yīng)用。本研究應(yīng)用乙酰化調(diào)控干預(yù)肝衰竭動(dòng)物，就是其抗炎功效發(fā)揮了作用。HDAC mRNA是乙酰化修飾的負(fù)相關(guān)指標(biāo)，在肝衰竭干預(yù)治療過程需要增強(qiáng)機(jī)體的乙酰化作用，減弱去乙酰化作用，從而促進(jìn)肝衰竭病情的緩解[6]。乙酰化調(diào)控在肝臟衰竭干預(yù)過程中的作用日漸明顯，首先通過乙酰化調(diào)控降低HDAC mRNA在靶向器官中的表達(dá)。在干預(yù)肝組織炎癥，促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)和誘導(dǎo)肝衰竭病情好轉(zhuǎn)方面發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步佐證了控制肝臟的炎癥反應(yīng)能阻斷肝衰竭進(jìn)展。定量檢測受損器官HDAC mRNA擴(kuò)增水平是監(jiān)測機(jī)體乙酰化程度重要的組分。