基于rs-fMRI技術探討臭氧水對膝骨性關節炎疼痛患者鎮痛作用的中樞機制

田明月，陳云杰，丁小芬，張儒雅，宋巧燕，韓松辰，周友龍

作者單位：1.河南中醫藥大學針灸推拿學院，鄭州450046；2.河南中醫藥大學國際教育學院，鄭州450046

膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是以關節軟骨破壞為主要病理表現，以進行性關節疼痛、功能受限為臨床特征的慢性疼痛性疾病[1]。KOA好發于中老年人，具有高發病率和高致殘率的特點。流行病學調查顯示，截止2018 年，我國成人KOA 總患病率約為15%，年齡大于60 歲者達50%，大于75 歲者則高達80%[2]。隨著全球人口老齡化的加劇，到2040 年在亞洲65 歲以上KOA 的患病率估計增長為現在的兩倍[3]，患者生活質量和生產力的下降造成了嚴重的個人和社會負擔。目前還沒有獲批準的能減緩KOA 病情相關的結構進展的療法，因此，保守治療的主要目標是提供癥狀緩解、改善關節功能，并推遲手術干預。KOA的藥物治療，如一線非甾體抗炎藥[4]，關節腔內藥物注射從皮質類固醇到透明質酸和生物制品，雖均能短期內緩解疼痛改善KOA患者癥狀，但長期或頻繁使用具有明顯的副作用[5]。臭氧水關節腔沖洗配合穴位注射治療KOA能明顯減輕患者的疼痛，改善患者的關節功能，具有臨床療效確切、安全可靠的特點[6]。與其他藥物相比，臭氧水療法能明顯改善KOA患者的預后、且無毒副作用，引起了越來越多醫療工作者的廣泛關注。臭氧水療法以其顯著的臨床療效和安全優勢在國內部分地區得到推廣并受到了患者的一致認可，但是由于臭氧水對KOA患者鎮痛作用的中樞機制尚不明確，嚴重限制著臭氧水療法在臨床上更廣泛的推廣應用。

靜息態功能磁共振成像(resting state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI)因其具備分辨率高、無創傷、無輻射等優點被廣泛用于研究慢性疼痛的中樞機制[7-8]，也為臭氧水對KOA鎮痛作用機制的研究提供了新的技術手段。本研究選用臭氧水療法的優勢病種KOA作為研究對象，采用fMRI技術提取KOA患者腦功能變化特征，同時運用ReHo分析方法研究KOA患者臭氧水治療前后的腦功能變化，探討臭氧水治療KOA鎮痛作用的中樞調節機制，為臭氧水治療KOA的臨床鎮痛效應尋找理論依據。

圖1 KP1點定位 圖2 KOA患者臭氧水治療前后VAS評分變化Fig.1 Point positioning of KP1. Fig.2 Changes in VAS scores of KOA patients before and after ozone-water treatment.

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年6 月至2019 年10 月來河南中醫藥大學第三附屬醫院就診的膝骨性關節炎患者18 例。所有的患者均處于膝關節慢性疼痛發作期。采用臭氧水治療前后自身對照的原則。本研究通過河南中醫藥大學第三附屬醫院倫理委員會批準，所有被試均被告知相關事項并簽署知情同意書。

納入標準：(1)符合膝骨性關節炎患者的中、西醫診斷標準；(2)年齡40～70 周歲，右利手；(3)患者入組前1個月內未接受規律治療；(4)膝關節疼痛持續或反復發作的時間超過3 個月；(5) VAS 評分≥4 分；(6)無鎮痛藥物、煙、酒等長期使用或成癮史；(7)患者本人簽署或者直系家屬代簽知情同意書。

排除標準：(1)合并有其他風濕類、骨關節炎類等伴有疼痛癥狀的疾病；(2)關節內骨折急性期及患肢有血管神經損傷史者；(3)合并有嚴重心腦血管疾病、肝腎疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤患者；(4)膝關節周圍皮膚有破損者；(5)膝關節嚴重內翻、外翻畸形及關節腔消失者；(6)妊娠或哺乳期婦女；(7)過敏體質及臭氧水過敏者；(8)有MRI 檢查禁忌者；(9)伴有焦慮、抑郁等精神、神經類病患者；(10)在掃描中發現患者頭顱有明確病變或者頭顱解剖結構嚴重不對稱。

1.2 研究設備及材料

德國西門子3.0 T磁共振成像設備；醫用臭氧水制備儀(濟南三氧科技有限公司制造，SYZ-80A)；3M 1100 子彈型防噪耳塞；10 ml 和60 ml 注射器；無菌手套。

1.3 治療方案

患者仰臥位，膝下墊枕，髖關節外展外旋，膝關節屈曲135～145°。由助手進行常規消毒后，操作者戴無菌手套，鋪無菌洞巾。以KP1 為穿刺點。10 ml 注射器抽取1%和0.9% NaCl 注射液各1 ml 作為穿刺液，于KP1 處穿刺進針，皮下注射局麻藥后，繼續進針，當針尖有落空感時，提示進入關節腔。由助手持60 ml 注射器從臭氧水制備儀中抽取20 μg/ml的臭氧水，緩慢注入關節腔。盡量使臭氧水充滿整個關節腔隙，患者自覺有明顯憋脹感時，將臭氧水全部抽出。反復沖洗3 遍。 KP1 (knee point 1)定位：以右膝為例，髕底中點為12 點，順時針方向于1 點半處定為穿刺點，將其命名為KP1 (圖1)。每周治療1 次，共治療3次。

1.4 靜息態fMRI掃描

分別對每個受試者在治療前和治療3 周后進行結構像和靜息態磁共振掃描。掃描前，佩戴頭套固定以防止頭動，隔音耳塞以排除噪聲干擾。掃描過程中，要求患者保持清醒，睜眼，盡量不進行任何思維活動。掃描參數設置見表1。

1.5 觀察指標

疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)：分別于治療前后采用VAS 評分對患者膝關節疼痛程度進行評價。VAS 評分由一條100 mm 的水平線組成，最左邊寫著“沒有疼痛”，最右邊寫著“可能最嚴重的疼痛”。要求患者在這條線上做一個垂直標記，以顯示最能代表他們在過去一段時間所經歷的疼痛的位置。

表1 fMRI成像的掃描參數設置Tab.1 Scanning parameter settings of fMRI imaging

0 mm：沒有疼痛；10～30 mm：輕度疼痛(疼痛不影響工作及生活)；40～60 mm：中度疼痛(影響工作及生活)；70～90 mm：重度疼痛(影響睡眠，甚至不能入睡或者睡眠中痛醒)；100 mm：可能最嚴重的疼痛，無法忍受。

1.6 數據處理

采用DPARSF (Data Processing Assistant for Resting-State fMRI)軟件包進行數據預處理。步驟如下：(1)去除時間點數據：剔除最初10 個時間點的數據圖像；(2)消除間隔掃描導致的時間相位差進行時間校正；(3)頭動校正；(4)空間標準化；(5)空間平滑：降低空間噪音，提高信噪比，消除受試者腦結構間差異的目的；(6)去線性漂移：降低因機器工作升溫或者受試者適應帶來的基線漂移；(7)濾波：對所有信號進行低頻濾波(0.01 Hz＜f＜0.08 Hz)處理，去除如心跳、呼吸等低頻噪聲和磁共振掃描儀自身的高頻噪聲對受試圖像的影響。

ReHo 分析：對預處理后的fMRI 數據進行線性漂移和濾波處理。為保證標準化，將單個元素的ReHo值除以總的腦ReHo 值的平均值。最后，采用高斯平滑來降低空間標準化過程中產生的空間噪聲和誤差。在最終的空間圖像中，每個單獨元素的對應值反映了該區域大腦功能活動的標準化的ReHo 程度，然后對標準化的ReHo圖進行統計學分析。

1.7 統計學分析

臨床療效指標使用SPSS 25.0 進行數據統計分析，計量資料若符合正態分布，組內比較采用配對t檢驗；不符合正態分布或方差齊的計量資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。使用REST工具軟件進行高斯隨機校正的磁共振數據集分析結果(單個個體P＜0.01，連續體素值P＜0.05，蒙特利爾神經科學研究所坐標Z＞2.326)符合校正后的P＜0.05 被定義為有統計學意義。最后得出臭氧水治療前后KOA 患者有顯著差異腦區ReHo 值，并將ReHo 值的變化與VAS 評分變化進行Pearson 相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VAS評分

18 例KOA 患者臭氧水治療前后的VAS 評分進行統計分析，結果顯示，與治療前相比，KOA 患者VAS 評分顯著降低(P=0.000)，說明臭氧水能明顯減輕KOA患者的疼痛癥狀(表2；圖2)

2.2 KOA患者臭氧水治療前后ReHo值變化

與臭氧水治療前相比，KOA 患者大腦右側枕上回、右側枕中回、右側楔葉、右側角回ReHo值增高；右側中央溝蓋、右側島葉、右側顳上回、右側顳橫回、右中央前回、左側補充運動區、右側補充運動區ReHo值降低(表3；圖3)。

2.3 KOA 患者治療前后腦區ReHo 變化VAS 評分變化的相關性分析

提取臭氧水治療前后KOA 患者發生顯著變化腦區ReHo 值，再將變化的ReHo 與VAS 評分進行相關性分析，結果顯示，右島葉(r=0.657) ReHo 變化與VAS變化呈負相關，即臭氧水治療后隨著VAS 評分的下降，右腦葉的局部一致性逐漸升高(P=0.003)。未發現其他腦區ReHo 變化與VAS 評分變化的相關性(圖4)。

表2 KOA患者臭氧水治療前、后的VAS評分比較Tab.2 Comparison of VAS scores of KOA patients before and after ozone-water treatment

表3 KOA患者臭氧水治療前后ReHo變化(18例)Tab.3 Changes of ReHo in KOA patients before and after ozone-water treatment(n=18)

圖4 右島葉ReHo變化與VAS評分變化呈負相關Fig.4 Changes in ReHo in the right insula were negatively correlated with changes in VAS score.

圖3 KOA患者治療前后ReHo圖變化。暖色區域代表ReHo值增高，冷色區域代表ReHo值降低Fig.3 Changes of ReHo before and after treatment in KOA patients.Warm areas represent increased ReHo values and cool areas represent decreased ReHo values.

3 討論

3.1 rs-fMRI 的出現為疼痛腦機制的研究提供了技術支持

rs-fMRI 作為一種無創、實時、直觀的新方法，在慢性疼痛研究中得到了廣泛的應用[9]。與任務態的fMRI 相比，rs-fMRI 的優勢在于提供了更全面的大腦功能結構信息[10]。此外，ReHo 的數據分析方法不需要確定用于分析的基于假設的感興趣種子區域，使我們能研究整個大腦內在的激活模式。在檢測人腦功能中不可預測的和復雜的自發血流動力學反應方面極具敏感性，是評價靜息狀態腦活動的有力而可靠的指標。ReHo 假設給定體素在時間上類似于其鄰居的體素，反映了局部自發神經元活動的局部一致性。ReHo 值的增高或降低是局部腦區自發活動一致性增高或降低的反映，也是對疾病影響以及情感認知調控機制的提示[11]。

3.2 KOA 慢性疼痛相關的腦機制的研究為本實驗奠定了理論基礎

近年來，研究人員利用rs-fMRI 發現了KOA 腦功能改變，為KOA 患者疼痛發病的中樞機制提供了證據參考[12]。基于腦功能連接度的分析，肖陽等[13]以伏膈核為種子點，發現慢性疼痛的KOA 患者相較于正常人連接增強的腦區有雙側伏膈核與雙側前扣帶回、左側尾狀核和右側顳極，而雙側伏膈核與右側背外側前額葉、左側次感覺區、雙側角回功能連接減弱，且患者疼痛評分隨著中伏膈核與右側背外側前額葉及左側次感覺區功能連接增強或減弱而發生相應的改變。從而推測中樞多巴胺系統相關腦區伏膈核與認知控制、情緒調節、感覺加工相關腦區及默認網絡功能連接的異常可能是KOA 患者疼痛發生的機制之一。基于體素的形態測量學分析，研究發現與健康對照組相比膝關節疼痛的KOA 患者，大腦灰質體積顯著下降，幾乎是年齡相關的2 倍，其主要涉及的腦區包括雙側眶額葉皮質、右側前額葉皮質以及中央前皮質和中央后皮質，結果表明，優先涉及前額葉皮質的慢性疼痛狀況可能被認為是一種“認知狀態”，對慢性疼痛的情緒和認知功能應給予高度重視[14]。Pujol 等[15]發現致敏KOA 患者在通常涉及疼痛區域以及之外的區域激活，延伸到聽覺、視覺和腹側感覺運動皮質。此外，KOA 患者中有一部分具有中樞介導的疼痛敏感化可能是由于棘上介導的抑制減少，傷害性信號的易化，并與疾病發展的預后密切相關[16]。已有的結果證明，疼痛的KOA 患者大腦在幾個腦區都顯示出局部連接和活動異常。這些大腦區域中的大多數，如額葉、頂葉、顳葉、頂葉、小腦、丘腦、島葉和邊緣系統等，都屬于“疼痛矩陣”，它被定義為隨著疼痛程度的增加而表現出可靠激活的區域，它們廣泛參與疼痛發生的認知、情感。

3.3 臭氧水對KOA 患者鎮痛作用的腦機制的闡明填補了臭氧水中樞鎮痛機制的空白

KOA 以慢性疼痛為主要臨床表現，是慢性疼痛的良好載體，國內外學者以KOA 為疼痛模型，運用靜息態功能磁共振技術對各種干預方法鎮痛作用的中樞機制進行了深入研究和探討[17-18]。Yue等[19]研究撲熱息痛治療KOA患者疼痛的腦功能機制中發現，撲熱息痛的鎮痛作用的發揮與感覺皮層和緣上回中BOLD信號的激活減少有關。Liu 等[20]通過研究發現，不同的運動方式可以通過調節背外側前額葉皮質起到改善KOA 患者疼痛的作用。醫用臭氧水是臭氧和生理鹽水發生充分混合作用產生的一種無色、透明、略帶腥臭味液體，因其具有顯著抗炎鎮痛作用而被廣泛應用于KOA[21-22]的治療，并取得顯著的療效。近年來，臭氧水對疼痛控制的外周作用已經得到一定的認識。研究表明，臭氧水可抑制患者關節液內多種炎性因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和受體，抑制磷脂酶A2 和P 物質等致痛物質的釋放，起到抗炎鎮痛作用[23]。然而，臭氧水對KOA鎮痛作用的中樞機制尚屬空白，研究臭氧水抗炎鎮痛如何作用于中樞神經系統，將有助于臭氧水中樞機制的闡明，為臭氧水療法在臨床更廣泛的推廣應用奠定堅實的基礎。

本研究顯示，臭氧水治療后KOA 患者的VAS 評分較治療前顯著降低(P＜0.05)，差異具有統計學意義，進一步證明了臭氧水能明顯改善KOA 患者的疼痛癥狀，療效確切。此外，臭氧水治療后，KOA 患者右側枕上回、右側枕中回、右側楔葉、右側角回ReHo值增高，說明臭氧水治療后患者對疼痛感覺的調控能力增強。臭氧水治療后，右側中央溝蓋、右側島葉、右側顳上回、右側顳橫回、右側中央前回、左側補充運動區、右側補充運動區ReHo值降低，說明臭氧水治療調整了患者的疼痛感受、注意和認知處理能力。以上表明臭氧水治療可能是通過調節顳葉、頂葉、額葉、枕葉等腦區的功能達到治療KOA 的作用。石愛軍等[24]發現KOA疼痛患者雙側額葉、頂葉、顳葉、等腦區ReHo 值廣泛異常，本研究結果顯示臭氧水正是通過調整這些腦區的ReHo 活動來達到鎮痛的目的，與石等研究具有一致性。

島葉位于大腦皮層與基底節區的中間地帶，作為邊緣系統的一部分，參與疼痛網絡的組成，其前部與疼痛的情緒和注意力處理有關，主要負責痛覺情緒部分的傳遞，是內側痛覺系統的重要組成部分，而后部則是編碼疼痛強度的關鍵區域。綜上，島葉作為痛覺情感和感覺辨別的信息整合部位，慢性疼痛時島葉會發生可塑性的改變[25]。相關性分析結果顯示臭氧水治療后，右島葉(r=-0.657)ReHo 變化與VAS變化呈負相關。從而進一步推測島葉可能是臭氧水治療KOA 的關鍵腦區。分析臭氧水鎮痛作用的發揮正是通過調控慢性疼痛疾病患者疼痛信息的處理，改善情緒功能、認知功能損害的病理狀態。

3.4 問題與展望

本研究在臭氧水鎮痛作用中樞機制方面尚處于一個前期初探階段，在試驗設計和數據挖掘等方面都存在一定不足。本研究我們只采用了KOA 患者治療前后自身對照的方法，尚未排除安慰劑等因素對本試驗結果的影響，后續的研究中如果能夠加入安慰劑對照組或者空白對照組，將使得研究成果更具有說服力。綜上所述，本研究旨在通過比較臭氧水治療前后腦功能ReHo 的變化及其變化與臨床疼痛VAS 評分的相關性，探討臭氧水對KOA 患者鎮痛作用的中樞機制。以期我們的研究結果能為臭氧水療法在KOA治療中的臨床應用提供可視化參考的同時，促進臭氧水療療在臨床上更廣泛的推廣應用，為廣大KOA患者解除病痛。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。