基于PCR熔解曲線技術的結核分枝桿菌Spoligotyping基因分型的臨床應用研究

藍如束,葉 婧,羅 丹,覃慧芳,黃莉雯,蘇華斌,羅淋尹,林 玫

結核病仍然是嚴重危害人類健康的傳染病之一，每年大約有1 040萬人感染，140萬人死于結核，形勢十分嚴峻[1]。近年來，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)基因分型方法普遍用于結核病疫情處置和結核病分子流行病學研究。目前，用于MTB基因分型的主要方法有限制性片段長度多態性(IS6110-RFLP)、間隔區寡核苷酸分型技術(Spoligotyping)、可變串聯重復序列技術(VNTR)等[2]。這些方法普遍操作繁瑣、耗時長、結果判讀主觀性大，操作人員需要經過嚴格培訓。其中間隔區寡核苷酸分型技術(Spoligotyping)方法是最常用基因分型方法之一，傳統檢測技術是利用PCR方法擴增間隔序列，擴增產物與固定在雜交膜上的 43 個合成的間隔序列捕獲探針雜交，根據顯影結果判讀相應的間隔序列是否存在，進而得到菌株的基因型特征。其操作步驟多且非常繁瑣，結果需要人工判讀。近兩年來，廈門致善公司研制出一種利用PCR熔解曲線技術對結核分枝桿菌進行spoligotyping基因分型，該技術僅需3 h完成檢測，實現結果自動化判讀。本研究旨在應用Mcspoligotyping方法對臨床樣本進行檢測，評價其在結核病疫情處置及結核病分子流行病學研究中的應用價值。

1 材料和方法

1.1標本來源 949株菌株來源于2017年廣西結核病耐藥監測，監測期間收集臨床病人痰標本，應用羅氏培養基傳統固體分離培養方法獲得陽性培養物，經硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒別培養基確定為MTB。質控標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.2儀器和試劑 ZEESAN SLAN 96實時熒光定量PCR儀(廈門致善生物科技股份有限公司)、細菌超聲分散計數儀(廣東體必康生物有限公司)。結核分枝桿菌McSpoligotyping分型檢測試劑盒購買于廈門致善生物科技股份有限公司，試劑包含PCR MixA、PCR MixB、PCR MixC、MTBC酶、陰性和陽性對照。分枝桿菌菌種鑒定培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 采用CTAB法進行提取DNA[3]，在1.5 mL離心管加入400 μL 1×TE緩沖液并取滿環生長良好結核分枝桿菌，置于80 ℃水浴30 min滅活，將滅活好菌液在細菌超聲分散計數儀超聲1 min，使細菌充分分散，加入溶菌酶使細菌充分破壁，然后用SDS/蛋白酶K混合，用CTAB/NaCl溶液沉淀非核酸細胞碎片，用氯仿/異戊醇提取DNA，在提取液中加入異丙醇使DNA沉淀，沉淀物經洗滌且自然干燥后，加入50 μL 1×TE緩沖液使沉淀物充分溶解，置-20 ℃保存備用，作為基因分型和WGS檢測的DNA 模板。

1.3.2McSpoligotyping檢測方法

1.3.2.1McSpoligotyping方法原理 是采用熒光PCR熔解曲線法，選擇結核分枝桿菌所攜帶的43個特定的間隔序列作為檢測模型。首先，在高度同源的同向重復序列(DR,direct repeat)上設計一對通用引物，并利用這對通用引物擴增出間隔序列(S1-S43)；其次，根據每個間隔序列的DNA序列設計能夠與之特異雜交的熒光探針。每條熒光探針都帶有特征性的熒光標記和熔點溫度組合。當PCR產物中存在某一間隔序列時，相應的熒光探針就能與之雜交形成特征的熔解曲線峰；最后，通過這些熔解曲線峰的組成確認待檢樣品中所存在的間隔區，從而推斷樣本中所攜帶的結核分枝桿菌型別。對于每份檢測樣本需3個反應對其進行檢測，對應擴增試劑中的PCR MixA、PCR MixB、PCR MixC。

1.3.2.2PCR反應及熔解曲線分析 所有試劑從冰箱取出平衡至室溫。PCR反應液配液標準為：取n×19.75 μL PCR Mix(A/B/C)(n根據反應管數確定)和n×0.25 μL MTBC酶混合液加入到1.5 mL離心管中，振蕩混勻數秒，然后瞬時離心，配成PCR反應液，以每管20 μL分裝于PCR 反應管。用微量加樣器向每個PCR反應管加入相應的DNA樣品，并設陰陽性對照。采用致善SLAN96實時PCR儀進行擴增及熔解曲線分析。反應體系設為25 μL，PCR程序設置如下：50 ℃ 5 min→95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s→57 ℃ 15 s→72 ℃ 15 s)×50個循環。熔解曲線分析程序設置如下：95 ℃ 1 min→35 ℃ 1 min→35 ℃～90 ℃ 以 0.04 ℃/s的升溫速率進行熔解分析，且在此階段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道熒光信號。

1.3.2.3結果判讀 43個間隔序列有對應的熒光與熔點范圍，實驗運行結束后，分析軟件根據每個樣本的熒光與熔點組合，自動給出一個對應的43位的二進制碼。待測樣本，按以下規則判讀結果：①優先判讀HEX通道的內控熔解峰(IC，44 ℃～48 ℃)，如果無內控峰則判定該樣品無效，即不含結核分枝桿菌基因組DNA或濃度很低達不到檢測要求。②若對應的熔點范圍內有熔解峰，則該間隔子存在，表示為“n”；若無熔解峰，則該間隔子缺失，表示為“o”；最后的結果按間隔序列Sp1→Sp43的順序輸出。

1.3.3全基因組測序分析

1.3.3.1全基因組測序 由北京諾禾致源生物有限公司完成檢測，利用高通量二代Illumina 測序技術平臺，進行DNA 片段文庫構建，雙端測序，PE150，深度至少200X，每個樣品總測序深度數據量≥1G clean data。測序數據經過過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質量數據，得到的Clean Data用于后續分析。

1.3.3.2基于全基因組序列對結核分枝桿菌分離株Spoligotying分析 將每株菌株全基因組原始數據通過python2.7軟件進行處理，再經過Blastn軟件進行序列比對提取出43個間隔序列，每個菌株的43個特定間隔序列結果轉化為二進制(0和1)形式輸出[4]。

1.4數據分析 將Spoligotying結果數據與SITVITWEB數據庫進行比對，獲取間隔區寡核苷酸國際型別(spoligotype intemationaltype，SIT)編號，通過PHYLOViZ 2.0軟件[5]和https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces網站對結果進行聚類分析并構建進化樹，在https://itol.embl.de網站對進化樹進行修飾。

2 結 果

2.1WGS和McSpoligotying兩種方法檢測結果一致性 本研究有361株菌株通過WGS和McSpoligotying兩種方法進行結核分枝桿菌Spoligotying基因分型，以WGS方法作為對比方法，McSpoligotyping結果一致性為94.18%(340/361)，有21株結果不一致。361株菌株共檢測15 523間隔序列，其中21株結果不一致表現在25個間隔序列，不一致率為0.16%(25/15 523)，不一致較多間隔序列在第5間隔，有4株菌株出現2個間隔序列不一致，其余標本均為1個間隔序列不一致，具體見表1。

表1 21株MTB間隔序列不一致分布情況Tab.1 Inconsistent distribution of interval sequences in 21 MTB strains

2.2949株MTB McSpoligotying基因分型結果 949株菌株中新發現基因型為121株，已定義基因型為828株。其中已定義基因型共分為84種基因型，主要歸屬于5種基因家族(BEIJING、T、H、EAI、LAM)和3個家系(Lineage 1、Lineage 2、Lineage 4)[6]。在5種基因家族中BEIJING為60.48%(574/949)、T為21.81%(207/949) 、H為3.69%(35/949)、EAI為0.95%(9/949)、LAM為0.33%(3/949)，主要流行基因家族為BEIJING和T。在3個家系中Lineage 1為0.95%(9/949)、Lineage 2為60.48%(574/949)、 Lineage 4為25.82%(245/949)、未定義家系為12.75%(121/949)。具體分型結果見表2和圖1。375株非北京基因型和新發現基因型構建進行樹及各種基因類型在聚類圖中分布情況見圖2。

圖2 375株非北京基因型和新發現基因型菌株McSpoligotyping分型結果在聚類圖中分布情況Fig.2 Distribution of McSpoligotyping genotypes in a cluster map of 375 non-Beijing strains and newly discovered genotype strains

表2 949株MTB McSpoligotyping基因分型結果Tab.2 McSpoligotyping genotyping of 949 MTB strains

2.3成簇性分析 949株菌株中的822株聚為MTB歸類于49個簇(2～528株)，最大一簇為Beijing家族SIT1基因型，其余的有127株表現為獨特的基因型。主要流行簇分別為SIT1(55.64%，528/949)、SIT53(8.49%，80/949)、SIT52(2.21%，21/949)、SIT190(1.90%，18/949)、SIT50(1.69%，16/949)和SIT249(1.58%，15/949)，分屬于BEIJING、T1、T2和H3 基因家族，各個簇在McSpoligotyping分型結果中占比情況具體見表3。

表3 49個簇菌株在McSpoligotyping分型結果中占比情況Tab.e.3 proportion of 49 cluster strains among the McSpoligotyping genotypes

3 討 論

間隔區寡核苷酸分型(spoligotyping)是1995年由Kamerbeek J等[7]學者提出來，基于其標準化操作程序和可數字化的結果，多年來spoligotyping是研究結核分枝桿菌遺傳多態性和分子流行病學一種有價值的基因分型方法[8]。傳統膜雜交spoligotyping方法是利用PCR方法擴增間隔序列，擴增產物與固定在雜交膜上的 43 個合成的間隔序列捕獲探針雜交，根據顯影結果判讀相應的間隔序列是否存在，進而得到菌株的基因型特征。其操作步驟多且非常繁瑣，整個檢測過程耗時約8 h，結果需要人工判讀，容易出現樣本污染和判讀錯誤現象。近年來，不少學者提出完善傳統spoligotyping的方法。Honisch C等[9]學者利用MALDI-TOF MS平臺開發一種基于設計多對引物擴增，無需雜交，耗時約7 h。Ruettger A等[10]學者采用ArrayStrip平臺替代尼龍膜雜交，簡化了操作步驟和結果記錄過程，并能自動化處理信號和數據，耗時約4 h。2013年Ocheretina O[11]利用Luminex Magplex平臺在雜交過程采用磁性標記微球體，耗時約4 h。這些所謂的改善方法并未簡化PCR擴增后的一系列反應如雜交、顯影等，并且要求額外的設備，增加了實驗的復雜性和費用。

注：圖中的每個圓球及每種顏色均代表一種基因型，圓球內的數字為SIT號；圓球的大小表示相應的基因型所含的菌株數。圖1 949株MTB McSpoligotyping基因分型結果在聚類圖中分布情況Fig.1 Distribution of McSpoligotyping genotypes in a cluster map of 949 MTB strains

近兩年，曾小紅等[12]學者提出了一種新型的閉管檢測的spoligotyping方法，稱之為Mcspoligotyping。Mcspoligotyping是利用多色探針熔解曲線分析技術，僅需一步加樣操作即將DNA模板加到PCR反應管中，上機檢測僅需兩個多小時，分型結果由儀器自動判讀。和傳統spoligotyping方法相比較省略了PCR擴增后的一系列操作，避免了產物易污染、人工判讀錯誤等缺點。一批次可同時檢測30個樣本，整個過程耗時約3 h。曾小紅等利用來自4個結核病臨床實驗室收集的1 968份MTB樣本，對Mcspoligotyping方法進行多地區大樣本量的臨床評價，評估該方法的可行性。Mcspoligotyping和傳統膜雜交spoligotyping分型結果一致性達99.93%，結果表明Mcspoligotyping方法可在常規實驗室使用。本研究對361株菌株進行分型結果一致性為94.18%，有而間隔序列一致性為0.16(25/15 523)，不一致較多間隔序列分別在第5間隔，有4株菌株出現兩個間隔序列不一致，其余標本均為1個間隔序列不一致。出現不一致主要原因是間隔序列的變化會導致熔解峰轉移到一個較低的Tm區域，從而出現假陰性結果和/或假陽性結果。有學者報道[12]認為幾乎所有間隔序列不一致結果都是由間隔中的SNPs或插入引起的，由于間隔序列具有高度保守性，間隔序列這種改變也是比較少見。其次，PCR實驗室污染也有可能導致假陽性的結果。從本次研究結果可看出，該方法檢測結果不影響對結核病疫情處置和分子流行病學研究。

研究發現BEIJING基因家族與云南(55.72%)相當，低于福建(67.23%)、河南(83.53%)、陜西(86.21%)、北京(82.00%)[13-17]，表明BEIJING基因家族是我國的主要流行基因型，但地域性分布差異非常大，南方地區所占比例低于北方地區。而國家間的基因型分布差異也很大，東南亞國家[18]主要流行EAI和CAS，歐美地區[19]主要流行LAM和T，鄰國緬甸[20]主要流行BEIJING、EAI和LAM。

而非北京基因家族和新發現基因型占39.52%(375/949)，這類菌株存在高度的遺傳多態性(圖2)。非北京基因家族共有80個基因型，其中50個為獨立基因型。同時研究發現有121株為新基因型，歸屬于86個基因型，其中74個為獨立基因型，暫未被Spol DB4.0數據庫收錄。提示廣西結核分枝桿菌遺傳多態性非常豐富，是研究結核病進化和傳播、耐藥基因、疫苗等的理想現場。

本研究對成簇性進行分析，發現949株菌株中的822株聚為MTB歸類于49個簇(2～528株)，成簇率為86.62%(822/949)，有127株菌表現為獨特的基因型。在成簇的基因型中，BEIJING基因家族占比最大，與羅丹[21]報道的56.95%接近，低于北方的一些省份(82.18%)[22]，但仍是廣西目前最主要的流行基因型，提示BEIJING基因家族有可能具有更強的傳播力，有待進一步研究證實。在49個簇中，大部分簇中每個簇的菌株來源相同一個地方，說明結核病傳播大多數可能是近期傳播造成。因此，應開展早期快速診斷和治療，切斷傳播源，防止結核病疫情進一步傳播。

綜上所述，本研究利用Mcspoligotyping方法對949株結核分枝桿菌進行基因分型。初步了解到廣西地區結核分枝桿菌基因遺傳分布和成簇情況，提示廣西地區結核分枝桿菌存在高度的遺傳多態性和結核病傳播情況。Mcspoligotyping方法操作簡單、耗時短、費用低，大部分地區均可開展，對結核病疫情以及結核病分子流行病學研究具有重要意義。

(志謝：廈門大學生命科學學院許曄和曾小紅博士對本研究給予了科學指導。)

利益沖突：無