豬帶絳蟲Ts14-3-3.2重組蛋白誘導小鼠免疫應答的研究

劉美辰，歐陽任輝,2，羅 波，周必英

14-3-3蛋白是一種在真核生物中廣泛存在且高度保守的蛋白質家族[1]，其蛋白二聚體可結合多種靶蛋白，通過讓2個靶蛋白相互靠近而產生作用，因此很多學者將其看作一種接頭蛋白或配體蛋白(adaptor proteins)[2]，從而參與了細胞信號轉導、分裂增殖、衰老凋亡、酶活性的調節、細胞骨架的塑造等多種重要的生命活動[3]。

目前，很多學者以寄生蟲14-3-3蛋白作為一種候選疫苗分子進行了廣泛的研究[4]。課題組前期已證實豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中Ts14-3-3.2在基因[5]和蛋白(另文發表)水平上均有表達，并在成功制備了Ts14-3-3.2重組蛋白的基礎上(另文發表)，本研究將該重組蛋白免疫昆明小鼠，采用間接ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性IgG及其亞類(IgG1、IgG2a)水平；通過CCK-8法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞增殖反應；雙抗夾心ELISA法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平，進一步觀察其誘導小鼠產生的免疫應答水平，旨在初步探究該重組蛋白的免疫原性，為進一步用于抗囊尾蚴感染的免疫保護力研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1Ts14-3-3.2重組蛋白來源 課題組前期已通過pC2nl質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系成功制備了較高純度的Ts14-3-3.2重組蛋白，其相對分子質量約為29 kDa，利用該重組蛋白制備的免抗Ts14-3-3.2多克隆抗體可與豬帶絳蟲成蟲及囊尾蚴中的天然Ts14-3-3.2蛋白發生反應。

1.1.2實驗動物 60只6～8周齡SPF級雌性昆明小鼠，購自重慶實崠生物技術有限公司[許可證號：SCXK(遼)2015-0001]。本實驗已通過遵義醫科大學動物中心審查，符合動物倫理要求。

1.1.3主要試劑儀器 小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒(天津灝洋生物制品有限公司)；RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)；刀豆蛋白A(Concanavalin A, ConA)、弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)(美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(英國Abcam公司)；TMB顯色液、ELISA抗原包被稀釋液、HRP酶標抗體稀釋液(北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(美國AXYGEN公司)；鼠IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測試劑盒(北京誠林生物公司)；其它試劑均為國產分析純或化學純。CO2培養箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(中國蘇凈集團)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 方 法

1.2.1實驗動物分組與免疫 將60只全雌性昆明小鼠隨機分為5組，每組12只，分別為Ts14-3-3.2重組蛋白50 μg劑量組、100 μg劑量組、150 μg劑量組以及弗氏佐劑對照組和PBS對照組。Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組采用重組蛋白與等體積CFA充分乳化后進行，間隔14 d后加強免疫1次，連續2次，加強免疫采用等體積IFA乳化，對照組分別注射相應弗氏佐劑和PBS。均以多點皮下注射方式接種。

1.2.2小鼠血清標本采集 在首次免疫后0 d、28 d、56 d每組各取4只小鼠，眼球摘除采血，分離血清，-20 ℃凍存待查。以Ts14-3-3.2重組蛋白(40 μg/mL)作為抗原包被酶標板，每孔100 μL；以小鼠血清(1∶100稀釋)為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)、IgG1(1∶1 000稀釋)、IgG2a(1∶1 000稀釋)為二抗，采用間接ELISA法測定血清特異性IgG及IgG1、IgG2a水平。

1.2.3小鼠脾淋巴細胞懸液制備 以無菌操作解剖取小鼠脾臟，按小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒說明書制備脾淋巴細胞懸液，并使用10%胎牛血清的RPMI 1640培養液稀釋至濃度為5×106/mL，備用。

1.2.4脾淋巴細胞增殖水平的測定 采用CCK-8法對脾淋巴細胞增殖水平進行檢測。每份小鼠標本均分設原液組、ConA刺激組、Ts14-3-3.2抗原刺激組，以1.2.3獲取的脾淋巴細胞懸液200 μL/孔加至96孔細胞培養板中(即：每孔加入了1×106個脾淋巴細胞)，將Ts14-3-3.2重組蛋白和ConA各取2 μg分別加入抗原刺激組和ConA刺激組，混勻，置于5% CO2培養箱中培養46 h后，各組各孔分別加入CCK-8溶液20 μL，混勻，繼續置于5% CO2培養箱中培養2 h，使用酶標儀測定波長450 nm處的OD值(即OD450值)。

1.2.5脾淋巴細胞培養上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平的測定 每份小鼠標本均分設原液組、ConA刺激組、Ts14-3-3.2抗原刺激組，以1.2.3步驟獲取的脾淋巴細胞懸液0.5 mL/孔加至24孔細胞培養板中，將Ts14-3-3.2重組蛋白和ConA各取5 μg分別加入抗原刺激組和ConA刺激組，混勻，置于5% CO2培養箱中培養48 h，將各組各孔培養液4 000 r/min離心，收集上清液，-20 ℃凍存待查。采用雙抗夾心ELISA法檢測上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10濃度。

2 結 果

2.1小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a水平 如表1～3所示，小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組均在首次免疫后第28～56 d顯著升高且在56 d顯著高于28 d，以及同時段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組(IgG：F=3365.893,P<0.05；IgG1：F=7879.129,P<0.05；IgG2a：F=4273.769,P<0.05)；同時段佐劑組與PBS組相比，差異無統計學意義。

表1 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG水平值)Tab.1 Level of specific IgG in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表2 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG1水平值)Tab.2 Level of specific IgG1 in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表3 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG2a水平值)Tab.3 Level of specific IgG2a in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

2.2小鼠脾淋巴細胞增殖水平 如表4所示，小鼠脾淋巴細胞增殖水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組經抗原及ConA刺激，均在首次免疫后28～56 d升高，抗原刺激組免疫后28 d達到峰值，ConA刺激組58 d仍顯著高于28 d，同時段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組，以及同時段同組內，ConA刺激組>抗原刺激組>空白原液組(F=339.571，P<0.05)；佐劑組與PBS組相比，差異無統計學意義。

表4 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞增殖水平值)Tab.4 Level of spleen lymphocyte proliferation in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

2.3小鼠脾淋巴細胞培養上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平 如表5～8所示，小鼠脾淋巴細胞培養上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組均在首次免疫后28～56 d升高，免疫后第28 d達到峰值，同時段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組；以及同時段同組內，ConA刺激組>抗原刺激組>空白原液組(IL-2：F=253.527,P<0.05；IFN-γ：F=351.819,P<0.05；IL-4：F=103.935,P<0.05；IL-10：F=233.754,P<0.05)；佐劑組與PBS組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清液IL-2水平值)Tab.5 Level of IL-2 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表6 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清液IFN-γ水平值)Tab.6 Level of IFN-γ in spleen lymphocyte culture supernatant inmice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表7 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清液IL-4水平值)Tab.7 The level of IL-4 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表8 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清液IL-10水平值)Tab.8 Level of IL-10 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

3 討 論

囊蟲病是一種對人體健康危害極大的人獸共患寄生蟲病，囊尾蚴的寄生可引起不同部位發生病變，其中以腦囊蟲病最為嚴重，存在較高的致殘率、致死率，并且由于囊蟲病臨床癥狀復雜多樣，易與其它顱內疾病混淆而誤診誤治。該病呈全球性分布，在我國西南地區和一些少數民族地區由于醫療衛生水平相對較低、飲食習慣不良，囊蟲病仍然有散在病例[6-8]。研究表明，囊蟲病的發生不僅有體液免疫應答的參與，也有細胞免疫應答的參與[9-10]。

IgG是血清主要的抗體成分，由脾、淋巴結等部位的漿細胞合成分泌，以單體形式存在，可分為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4等亞型，Th1型細胞因子促進B細胞產生IgG2a抗體亞型，Th2則促進IgG1和IgE的產生，因此IgG1和IgG2a水平也可提示免疫應答的類型和強弱[11-13]。本研究通過測定免疫小鼠血清IgG1和IgG2a水平，兩者比例平衡，提示為Th1/Th2混合型免疫應答，與雷娜等[14]、曾瑞紅等[15]的研究類似，在寄生蟲14-3-3重組蛋白研究領域，華支睪吸蟲[28]、日本血吸蟲[16]和旋毛蟲[17]14-3-3重組蛋白可誘導產生IgG1和IgG2a，與本研究相仿，而細粒棘球絳蟲14-3-3重組蛋白誘導產生抗體傾向于IgG2a[18]。此外，本研究中三種抗體水平在一定范圍內均呈現劑量-效應關系，與劉慶中等[16]、鄭姣等[19]的結果類似。

淋巴細胞增殖是免疫系統接觸抗原后，淋巴細胞發生增殖分化以發揮免疫學效應，其增殖水平反映了淋巴細胞的數量，進而反映了機體細胞免疫應答能力，常用于評價淋巴細胞的活性，而ConA作為一種絲裂原，可非特異性地刺激T淋巴細胞發生增殖[20-23]。目前最常用的淋巴細胞增殖測定方法包括四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法和CCK-8法，兩者均快速簡便、靈敏度高，無放射性污染，特別適合大批量檢測，尤其在檢測懸浮細胞增殖中具有優勢，其中MTT法相對CCK-8法操作仍顯繁瑣，往往因甲臜顆粒溶解不全影響實驗結果，靈敏度也不及后者[24]，因此有學者認為CCK-8法優于MTT法[20,25]。由于小鼠淋巴細胞增殖實驗影響因素較多，有學者認為采用5×106/mL的脾細胞濃度、2～10 μg/mL的ConA刺激濃度可能是該實驗的最佳條件[21]。本研究采用CCK-8法，5×106/mL脾細胞濃度，陽性對照采用10 μg/mL ConA刺激，對小鼠脾淋巴細胞增殖水平進行測定，結果顯示不同劑量Ts14-3-3.2重組蛋白免疫昆明小鼠后，體外抗原刺激脾淋巴細胞出現明顯增殖，與王強等[26]結論類似，其增殖水平均于28～56 d升高并于28 d達到峰值，高劑量組明顯高于低劑量組，呈現劑量-效應關系。

根據原始CD4+T細胞受抗原信號刺激分化后產生細胞因子，可分為Th1與Th2兩種細胞亞群[27]。其中，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，介導細胞免疫應答，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-β等，介導體液免疫應答[28]，這兩種細胞亞群之間存在動態平衡及相互抑制[29-31]。其中Th1應答有利于機體清除感染原，但容易引發宿主自身損害；Th2應答參與抗寄生蟲的保護性免疫，但也可能引起感染的慢性化[32]，Th1型免疫應答所誘導的抗寄生蟲免疫保護力顯著高于Th2型[33-35]。通過測定T細胞所產生細胞因子的類型和水平，可以明確免疫反應的類型和強弱[36]。對囊蟲病而言，Th1和Th2應答同樣在其發生、發展過程中同樣起著非常重要的作用[9]。本研究通過Ts14-3-3.2重組蛋白聯合弗氏佐劑免疫小鼠，測定培養脾淋巴細胞所產生的Th1型細胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2型細胞因子(IL-4、IL-10)，觀察到Ts14-3-3.2重組蛋白可誘導Th1/Th2混合型免疫應答，與抗體測定結論相符，這與既往研究發現的重組蛋白常可刺激機體產生Th1/Th2混合型應答[14-15, 37]結論相一致，但某些重組蛋白誘導Th2型為主[38]，也有免疫初期Th1型，后期轉為Th2型為主的報道[39]。在寄生蟲14-3-3重組蛋白免疫效應的一系列研究中，通過細胞因子測定發現旋毛蟲14-3-3重組蛋白可誘導小鼠產生Th1/Th2混合型應答[17]，與本研究類似，而細粒棘球絳蟲14-3-3重組蛋白則誘導Th1型主導的免疫應答[18]，可能與不同蟲種蛋白差異有關。某些添加物(如佐劑[40])還可調節蛋白誘導的免疫應答使之以Th1型為主[41-43]，因此通過免疫調節劑增強免疫效果也是研究方向之一。

本研究通過對比小鼠免疫前后的血清中特異性抗體及其亞型水平變化，并檢測重組蛋白體外刺激小鼠脾淋巴細胞所產生的細胞因子水平，初步明確了Ts14-3-3.2重組蛋白誘導小鼠產生的免疫應答變化趨勢。結果表明，Ts14-3-3.2重組蛋白在28～56 d均誘導Th1/Th2混合型免疫應答，而免疫系統發揮的效應是體液免疫和細胞免疫綜合作用的結果，提示Ts14-3-3.2重組蛋白具有囊蟲病疫苗潛力。此外，細胞因子水平56 d均低于28 d，可能與免疫程序終止無進一步抗原刺激有關；抗體水平56 d高于28 d，可能與加強免疫誘導的再次應答所產生的抗體濃度高、體內持續時間長有關；免疫的最適劑量仍需要通過進一步增加抗原劑量才能明確。

此外，本研究觀察到原液組、各劑量抗原組、ConA組脾淋巴細胞增殖水平和細胞因子水平均表現為ConA刺激>抗原刺激>原液，表明ConA的非特異性刺激誘導的脾淋巴細胞增殖和細胞因子分泌水平高于抗原的特異性刺激，可能與抗原僅能特異性誘導脾淋巴細胞增殖和細胞因子分泌有關。

本文研究了以不同劑量Ts14-3-3.2重組蛋白，在不同時間誘導小鼠產生的免疫效果。結果表明該重組蛋白可誘導小鼠產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答，初步確定了較為合適的免疫劑量，為下一步進行該蛋白誘導的免疫保護力研究奠定了基礎。

利益沖突：無