化學竹漿廢水活性污泥細菌菌群結構分析

張安龍 王哲毅 王雪青， 羅 清 張仕南

（1.陜西科技大學環境科學與工程學院，陜西西安，710021；2.陜西科技大學輕工科學與工程學院，輕化工程國家級實驗教學示范中心，陜西西安，710021；3.西安隆華環保技術有限公司，陜西西安，710019）

竹材制漿企業多采用化學法制漿，其工業廢水主要由蒸煮過程中產生的糖類、有機酸、氨基酸、類黃酮、單寧和光敏色素等組成[1]。化學竹漿廢水組成復雜，且排放量大，濃度和色度高[2-4]，處理困難。一般使用物理、化學和厭氧、好氧聯合的方法來處理造紙廢水[5]，如絮凝沉淀[6]結合生物酶處理法[7]。隨著科技水平的不斷提升，對于工藝的研究亦不斷深入，盡管當前已經取得了不錯的進展，但受到技術水平的制約，尚有很多問題亟待解決；尤其是對關鍵的微生物群落結構了解還不夠深入，使對此類廢水的處理效率不能得到有效提升，從而使后端深度處理的成本偏高[8]。使用生物強化技術可提高難降解有機物的去除效率，對菌種進行篩選或將菌種進行基因改造形成高效降解菌并加入到系統內，可有效處理特定種類的有害物質。對于微生物群落結構的深入研究將有利于提高特征污染物的去除效率。

生物處理單元中復雜的微生物群落結構對于廢水處理有指導作用，尤其是厭氧處理。邢雅娟等人[9]研究了UMIC 反應器微生物的縱向分布，發現細菌的多樣性高于古菌，且反應器的空間維度也會影響微生物的菌落結構。易敏等人[10]比較了廢紙制漿廢水與蔗渣噴淋廢水厭氧顆粒污泥中的微生物群落，結果表明細菌的種類和豐度受底物成分及周圍理化環境（包括重金屬成分）影響較大。郭建國等人[11]比較了蘆葦制漿造紙廢水的細菌群落變化，優勢菌由γ變形菌和衣原體變為α變形菌，說明微生物群落構成及其多樣性在不同的外界環境調控下會隨時間進行動態演變。

Xia 等人[12]利用454 高通量測序，使用厭氧膜生物反應器和竹炭增強的厭氧膜生物反應器處理竹漿制漿廢水的古菌群落，發現此系統中甲烷螺旋菌和甲烷細菌在甲烷生產中占主導地位；竹炭的增加提高了微生物多樣性，促進了甲烷菌體的活性，提高了系統的COD 去除率和甲烷生成率。劉春等人[13]對EGSB 反應器處理竹漿制漿廢水的過程和啟動規律進行分析，但并未對群落結構進行解析。厭氧處理雖然起著重要作用，但好氧處理的出水水質決定著深度處理的成本。Liang 等人[14]以楊木化機漿制漿廢水為目標，研究了EGSB 反應器和曝氣活性污泥的微生物群落結構；在EGSB 反應器中，優勢菌為Euryarchaeota，豐度為40.5%，曝氣活性污泥的優勢菌門為放線菌門和變形菌門，豐度分別為40.0%和28.6%。實際化學竹漿廢水進水COD 較低，常見的處理方法為活性污泥法，處理率及成本受其菌群的復雜性及多樣性影響較大，然而現階段對化學竹漿廢水活性污泥菌群結構及生物多樣性的研究仍未見報道。

因此，本研究針對4 個不同化學竹漿廢水處理廠樣品，使用超高通量基因組454高通量測序技術，對其菌群結構及生物多樣性進行研究，旨在為當前的微生物法處理難降解有機物中微生物種群結構調控提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性污泥取自4 個不同化學竹漿廢水處理廠（永豐紙業股份有限公司、永豐漿紙股份有限公司、鳳生紙業科技股份有限公司、金福紙品有限責任公司），處理工藝分別為水解+好氧、好氧（流量1200 m3/h）、好氧（流量800 m3/h）、ABR（厭氧折流板反應器）+好氧（以好氧為主），編號分別為1#～4#。化學竹漿廢水CODCr含量為500～1500 mg/L，停留時間為24～32 h。具體指標如表1所示。

表1 化學竹漿廢水主要水質指標和好氧單元工藝參數Table 1 Main water quality indexes and oxygen unit process parameters of chemical bamboo pulp wastewater

1.2 污泥細菌總DNA提取、PCR和16SrDNA測序

將樣品在-20℃下冷凍保存，加干冰運輸至上海美吉生物醫藥科技有限公司完成PCR（聚合酶鏈式反應）擴增和16SrDNA 測序。細菌總DNA 的提取工作利用E.Z.N.A.? soil 試劑盒完成；利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4 可變區進行PCR擴增；擴增程序為95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）；擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物，0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA 模板。各樣品進行PCR 擴增后，再通過Miseq PE300 進行測序。通過Trimmomatic 對原始序列數據進行操控，使用FLASH 軟件進行拼接。使用UPARSE 軟件，基于OUT 聚類使用97%的相似度對序列進行操作，之后在該過程中將單序列及嵌合體排除，利用RDP classifier將所有序列中的物種標注，并針對Silva 數據庫（SSU123）進行考量，將比對閾值設為70%。

2 結果與討論

2.1 細菌群落多樣性分析

將1#～4#樣品利用PCR 擴增和高通量測序后，得到的有效測序條帶在29116～48573 之間。同時，為保證研究有效的細菌群落結構豐富度，對其中97%相似水平序列進行多樣化研究，具體指標參照表2。由表2可知，4個樣品的平均覆蓋率均能達到99%以上，說明絕大多數菌群已經被檢測出來。OUTs（Operational Taxonomic Units）值，反映各菌群樣本的多樣性高低水平[15]。本研究中4個樣品生物分類單元OTUs分別為992、848、878 和692；Liang 等人[14]在研究楊木化機漿廢水曝氣反應器中的菌落結構時，得出其OUTs 達到1098，與本研究中1#樣品的數值相當，說明竹漿廢水和楊木化機漿廢水中的菌群樣本的多樣性基本相當。香農指數是菌落多樣性的另一個衡量參數[16]，其數值越高，則表示該樣本菌群的微生物多樣性越高；4 個樣品香農指數分別為5.13、4.87、5.19和4.48，與OUTs 值所反映出的微生物多樣性水平相一致。ACE 指數和Chao1指數均是衡量物種豐度的參數，即用來評估物種數目的多少，其數值越大，則表示其物種總數越多[17]。4 個樣品的ACE 指數區間為767.80～1066.15，Chao1 指數區間為769.70～1048.37。這是由于不同的竹漿廢水處理廠的處理手段和工藝不同，其群落多樣性也具有明顯的差異化。不同造紙原料產生的廢水，由于進水水質的差異，進一步導致了微生物群落結構的差異顯著化。

圖1為細菌群落豐度稀釋曲線圖。由圖1 可知，隨著測序的不斷增多，新菌群不斷被發掘，因此OTUs（圖1(a)）及香農指數（圖1(b)）均有著較為明顯的增加；在測序帶數量超過20000 時，OTUs 稀釋曲線末端出現一定程度地緩和，而香農指數稀釋曲線不再發生明顯變化，表明此次研究的序列深度能夠對菌群結構進行有效描述。

圖1 細菌群落豐度稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community abundance

表2 細菌群落多樣性指數Table 2 Bacterial community diversity indices

針對細菌多樣性指數和豐度稀釋曲線進行分析可知，化學竹漿廢水活性污泥細菌群落不同，且差異化較為明顯。圖2 為聚類分析熱圖及主成分分析圖。聚類分析熱圖中，種屬距離的遠近用顏色的深度表示；其中距離的遠近用紅色及綠色代表，紅色越深則說明距離越遠則其相似度也越低。分析發現3#樣品與其他3 種樣品間均存在明顯差異且差異值最為顯著。而3#樣品的香農指數也最大，說明3#樣品的微生物不僅具有較高的多樣性，而且種間差異較為顯著。通過對主成分進行研究發現，所有樣品菌落結構的分布均在3 個不同象限內，1#樣品與4#樣品位于同一象限，但距離相對較遠，可充分說明其結構差距較為顯著。菌落結構種間差異（種間距離）的大小也反應了水質成分的復雜程度，這主要是因為不同進水的污染負荷，經過物理水解酸化及厭氧處理后，使廢水中的部分大分子物質變為小分子物質，進一步增加了廢水成分的復雜程度，使各種菌屬在不同污染物（部分作為微生物生長的抑制物）的不斷選擇馴化中，群落結構表現出很大程度的差異性。2#樣品距離其他樣品較遠，且其進水CODCr值（表1）最高，進一步說明進水水質會直接影響細菌群落結構。

圖2 細菌群落結構聚類分析熱圖和主成分分析圖Fig.2 Cluster analysis and principal component analysis of bacterial community structure

2.2 細菌群落結構門水平上的組成和豐度

圖3 細菌群落結構門水平上的組成Fig.3 Bacterial community composition at phylum level

通過RDP classifier軟件對檢測后的序列進行物種分類，圖3 表示菌群結構在門水平上的組成和豐度。從圖3可以看出，4個樣品的優勢門主要有變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門，這與趙婷婷等人[18]的分析成果相似。在廢水處理中，變形菌門具有重要作用，且其豐度在4個樣品中的所有優勢門中也最高（59.47%），因此得到了廣泛關注[19-21]。綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門為活性污泥細菌群落結構中的優勢門，其豐度分別為10.08%～21.66%、5.14%～18.34%、3.59%～18.86%；綠彎菌門在4個樣品中的豐度分別為10.87%、21.66%、14.13%和10.08%，這與Mclellan等人[22]的研究結果一致。4 個樣品中放線菌門豐度分別為4.03%、3.59%、18.86%和4.56%；厚壁菌門豐度分別為1.95%、1.18%、7.87%和0.36%，而有研究表明其在市政活性污泥中的豐度可達19%[23]。盡管已將4個樣品中大部分細菌門類鑒定出，然而受技術水平限制，仍有部分門類未被鑒定出，其豐度占比分別為2.51%、1.84%、1.93%和0.89%。Liang 等人[14]對楊木化機漿廢水好氧處理系統中的微生物群落進行分析，得出放線菌門的豐度為40.0%，變形菌門的豐度為28.6%；本文中放線菌門的豐度為55.89%，變形菌門的豐度為59.48%。因此同樣是造紙廢水，楊木化機漿與竹漿廢水優勢菌門類豐度具有較大差異。綜上所述，竹漿廢水與其他的造紙廢水微生物菌落分布有本質區別，主要原因是原料不同而導致廢水中碳源、氮源的比例不同，以及廢水中不同抑制物對微生物種群具有特定選擇性。

2.3 細菌群落結構目水平上的組成和豐度

在目水平上進行分類（每種目的豐度應至少保持在其中某一個樣品大于1%），結果如表3 所示。結果表明，4個樣品的前5類優勢目不同，1#樣品為Rhizobiales、Betaproteobacteriales、和Caulobacterales，豐度分別為18.79%、13.28%、8.61%、4.81% 和4.43%；2#樣 品 為Calditrichales、Chitinophagales、Rhizobiales、Sphingobacteriales和Caldilineales，豐度分別為9.56%、9.37%、8.15%、6.88%和6.41%；3#樣品為Betaproteobacteriales、Rhizobiales、Bacillales、Kineosporiales和Microtrichales，豐度分別為13.61%、13.52%、7.50%、5.71% 和4.05%；4#樣 品 為Rhizobiales、Betaproteobacteriales、Chitinophagales、Sphingobacteriales和Methylococcales，豐度分別為23.96%、14.61%、8.30%、8.11% 和3.78%。雖然4 個樣品共享了大多數的目，然其菌群結構存在明顯差異，如優勢目Rhizobiales豐度在4#樣品中為23.96%，在1#樣品中為18.79%，在2#樣品中僅為8.15%。另外，Rhizobiales，Betaproteobacteriales、Chitinophagales在1#和4#樣品中的豐度也基本一致。此結果與圖2(b)菌落結構的種間差異的分析結果相吻合。

表3 細菌群落結構目水平上的組成和豐度Table 3 Bacterial community composition and abundance at order level %

從表1 的化學竹漿廢水主要水質指標分析結果可以看出，1#和4#樣品經水解和厭氧處理后進水的污染負荷較低，CODCr含量分別為500～800 mg/L 和500～1000 mg/L，生化處理后CODCr去除率較低。2#樣品的進水污染負荷較高，CODCr含量為1100～1500 mg/L，生化處理后CODCr去除率較高，2 個優勢目Calditrichales和Chitinophagales的豐度分別只占9.56%和9.37%。從圖2（b）的菌落結構的種間差異（種間距離）分析可知，2#廢水的菌落結構差異最為顯著；因此進水特征性污染物的濃度及種類的差異可以引起進水CODCr含量的不同，從而導致水質的根本性差異。處理工藝、水質及其他因素（如進水原料和地理位置等）均可引起菌群結構的差異，其中廢水水質是影響菌落組成的最關鍵因素[24-25]。

2.4 細菌群落結構屬水平上的組成和豐度

在屬水平上細菌群落結構的組成和豐度（每種屬的豐度至少在一個樣品中不小于1%）如表4 所示。從表4 可以看出，4 個樣品共享的主要屬為Hyphomicrobium、 Candidatus、 Competibacter、 JdFR-76 和SWB02。其中最大占比屬為生絲微菌屬，豐度為3.69%～18.29%，具有好氧反硝化作用[26]。盡管硝化螺菌屬、Nordella、Terrimonas和Bacillus為非優勢菌株，但被4個樣品所共享。硝化螺菌屬作為硝化細菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，從而促進生化系統的脫氮效率。Bacillus作為一種簡易的細菌，其能夠針對諸如碳系、氮系、磷系、硫系等污染物進行有效分解，也可分解蛋白質和復雜多糖，因此對于分解水溶性有機物有著顯著作用[27]。核心屬為生絲微菌屬、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中Pedomicro-bium可以降解多環類芳香族化合物，醇類及烷烴類物質[28-30]。可能是由于廢紙中污染物相對復雜，存在相對較多芳香族化合物被富集吸收并降解。若要維持化學竹漿廢水處理系統的穩定性，研究優勢微生物的活性和多樣化的群落結構間的相互關系有著至關重要的作用，其中構成活性污泥的微生物群體較為龐雜，深入探究多菌群的相互影響和協同作用污水處理最為關鍵的手段之一。

表4 細菌群落結構屬水平上的組成和豐度Table 4 Bacterial community composition and abundance at genus level %

3 結論

3.1 不同化學竹漿廢水好氧單元活性污泥中，微生物種群的結構差異主要由進水水質差異和處理工藝的不同，導致其不斷演變而形成了菌落結構的多樣性和差異性。

3.2 化學竹漿廢水好氧單元活性污泥細菌菌群結構組成中的優勢門為變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門，變形菌門最高豐度為59.47%；核心屬為生絲微菌屬、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中生絲微菌屬占主導地位，豐度為3.69%～18.29%。這些菌屬不僅與硝化、反硝化相關，還與多環芳香族類化合物，醇類及烷烴類物質的降解直接有關。