栝樓桂枝湯對腦缺血／再灌注損傷大鼠小膠質細胞極化的影響

程偉能，南麗紅，張玉琴，賴文芳，陳亞萍，黃 枚

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

腦卒中是一種由腦血管破裂或阻塞所引起的腦部血液循環障礙性疾病，據其發病機制不同可分為缺血性腦卒中及出血性腦卒中［1］，其中缺血性腦卒中是臨床最常見的腦卒中類型，約占腦卒中發生的70%～80%［2］。栝樓桂枝湯（GLGZD）出自《金匱要略》有補陰陽，調氣血，養營生津，柔潤筋脈之功效，主治痙證［3］。現代臨床將該方用于腦卒中后肢體痙攣的康復治療，療效確切［4］。研究表明，腦卒中后肢體痙攣是由于上運動神經元損傷所致，而腦缺血后的持續炎癥反應，可引起神經元死亡，是導致神經元功能障礙的關鍵因素［5］。小膠質細胞作為大腦常駐免疫細胞，在神經炎癥中扮演重要角色［6］。課題組前期研究發現GLGZD可通過多途徑抑制大腦皮層神經細胞的缺血性凋亡，改善缺血區神經細胞的病理狀態，減少腦梗死體積，發揮神經保護作用［7-9］，但作用機制尚未完全闡明。故本研究以小膠質細胞極化為切入點，進一步探索GLGZD緩解腦卒中后肢體痙攣的可能機制，為GLGZD的臨床應用提供科學依據。

1 材 料

1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠36只，體質量為（260±10）g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，許可證號為SCXK（滬）2017-0005，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，合格證號為SYXK（閩）2019-0007。

1.2 實驗藥物 栝樓（北京本草方源藥業科技有限公司，生產批號：190101）；白芍（廈門燕來福制藥有限公司，生產批號：180803）；桂枝（安徽孚眾藥業有限公司，生產批號：191101）；甘草（渭源衡順堂藥業有限公司，生產批號：006191217）；大棗（麻城九州中藥發展有限公司，生產批號：E1910311206）；生姜購買于福建承創堂藥店。

1.3 主要試劑 特超敏化學發光液（大連美侖生物技術有限公司）；抗熒光淬滅劑（美國Vecta公司）；DAPI染液（上海碧云天生物技術有限公司）；牛血清白蛋白（德國Biofroxx公司）；離子鈣結合銜接分子1（Iba1）一抗（美國Thermo Fisher公司）；精氨酸酶-1（Arg1）一抗（美國Affinity公司）；白細胞介素-4（IL-4）一抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；白細胞分化抗原86（CD86）一抗、白細胞介素-6（IL-6）一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；β-actin一抗、HRP二抗、核轉錄因子κBp65（NF-κBp65）一抗、兔熒光二抗、鼠熒光二抗（英國Abcam公司）；DAB顯色試劑盒、內源性過氧化物酶阻斷液、免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 主要儀器 PVDF膜（美國Millipore公司）；尼龍線栓（廣州佳靈生物技術有限公司）；石蠟切片機（美國ThermoFisher公司）；DM IL LED型倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；SZ760型體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；生物組織自動脫水機、生物組織石蠟包埋機、生物組織攤烤機（湖北孝感宏業醫用電子技術有限公司）。

2 方 法

2.1 GLGZD的制備 稱取栝樓30 g，桂枝9 g，白芍9 g，大棗9 g，生姜9 g，甘草6 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量飲用水，室溫浸泡30 min后加熱回流提取1.5 h。提取結束后用紗布過濾藥渣，再次加入8倍量的水并重復上述步驟。合并兩次濾液并濃縮至50 mL（藥物濃度為1.44 g／mL）。

2.2 造模、分組與給藥 將36只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組12只及造模組24只。造模組大鼠采用線栓法制備MCAO模型，術前禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg／kg）麻醉大鼠；將大鼠頸部中線開一切口，鈍性分離直至暴露出頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA）；線栓從CCA插入直至栓塞大腦中動脈，栓塞2 h后拔出部分線栓進行再灌注。假手術組除不栓塞大腦中動脈，其余操作與上述一致。待大鼠完全清醒，參照改良神經功能缺損評分（mNSS）［10］對大鼠的運動、感覺、平衡及反射進行綜合評價，mNSS評分在7～15分的大鼠為造模成功大鼠。將造模成功的大鼠按分層隨機原則分為模型組及GLGZD組，每組12只。各組大鼠均按1 mL／100 g體質量灌服給藥，GLGZD組灌服1.44 g／mL的GLGZD（即14.4 g／kg，相當于臨床人日用量的12倍），模型組及假手術組灌服蒸餾水，每天1次，連續7 d。

2.3 神經功能缺損評分采用mNSS評分法，分別在給藥前及給藥后第3、5、7天對各組大鼠神經功能缺損情況進行評價。

2.4 組織石蠟切片的制備 大鼠末次給藥2 h后，麻醉大鼠，用生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌注，以此除去組織內的血液并對組織進行初步固定。取腦并置于4%多聚甲醛固定24 h，用大鼠腦模具將大腦制成2 mm切片，并進行常規脫水、石蠟包埋、切片。

2.5 免疫熒光法檢測缺血側大腦皮層分化抗原86／離子鈣結合銜接分子1（CD86／Iba1）及精氨酸酶-1／離子鈣結合銜接分子1（Arg1／Iba1）陽性細胞率 石蠟切片常規脫蠟復水、抗原修復及封閉。滴加相應的一抗（Iba1、CD86、Arg1稀釋比均為1∶300），4℃條件下孵育12 h。滴加二抗（兔熒光二抗、鼠熒光二抗稀釋比均為1∶500），孵育2 h。滴加DAPI孵育15 min。吸棄切片上殘留的液體并用抗熒光淬滅劑封片。各樣本于倒置熒光顯微鏡400倍鏡下隨機攝取5個視野，并采用Image J圖像分析軟件計算同一視野下各指標陽性細胞率（即紅色熒光、綠色熒光與藍色熒光重疊的細胞占綠色熒光與藍色熒光重疊的細胞的百分率）。

2.6 免疫組化法檢測缺血側大腦皮層白細胞介素-6（IL-6）及白細胞介素-4（IL-4）蛋白的表達 石蠟切片常規脫蠟復水、阻斷內源性過氧化物酶活性、抗原修復及封閉。滴加相應的一抗（IL-6、IL-4稀釋比均為1∶200），4℃條件下孵育12 h。滴加二抗，孵育2 h。滴加SABC，孵育1 h。DAB顯色，并用蘇木素復染，封片。各樣本于倒置熒光顯微鏡400倍鏡下隨機攝取5個視野，并采用Image J圖像分析軟件計算同一視野下各指標蛋白表達（即棕黃色區域面積占圖片總面積的百分率）。

2.7 Western blot檢測缺血側大腦皮層核因子κBp65（NF-κBp65）蛋白的表達 大鼠末次給藥2 h后，立即處死大鼠并取缺血側大腦皮層組織。用裂解液提取組織中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液制成蛋白樣品。制備SDS-PAGE凝膠，進行電泳、轉膜、封閉，于4℃條件下孵育一抗（β-actin、NF-κBp65稀釋比均為1∶1 000）過夜。孵育HRP二抗（稀釋比均為1∶3 000）2 h，以特超敏ECL顯影液進行顯影拍照。結果使用Image Lab 4.1軟件對蛋白條帶進行定量分析。本實驗以β-actin為內參，目的蛋白相對表達量＝目的蛋白灰度值／β-actin灰度值，并參照假手術組對所得目的蛋白相對表達量的值進行歸一化處理。

2.8 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料屬正態分布的以表示，采用單因素方差分析，非正態分布的采用非參數檢驗。

3 結 果

3.1 3組大鼠mNSS評分比較 見表1。

表1 3組大鼠mNSS評分比較（±s） 分

表1 3組大鼠mNSS評分比較（±s） 分

注：與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

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3.2 3組大鼠缺血側大腦皮層CD86／Iba1及Arg1／Iba1陽性細胞率比較 見圖1及圖2。

3.3 3組大鼠缺血側大腦皮層IL-6及IL-4蛋白表達比較 見圖3及圖4。

3.4 3組大鼠缺血側大腦皮層NF-κBp65蛋白表達比較 見圖5。

4 討 論

本實驗采用線栓法制備MCAO模型大鼠并用mNSS評分法對各組大鼠神經功能缺損程度進行評價。實驗結果表明，模型組大鼠mNSS評分明顯高于假手術組（P＜0.01），提示造模成功。經GLGZD干預后，GLGZD組大鼠mNSS評分在給藥后第3天、5天、7天與模型組比較均明顯降低（P＜0.05或0.01），提示GLGZD可顯著改善MCAO模型大鼠神經功能缺損，對缺血性腦損傷具有較好的保護作用。

目前研究認為，腦缺血后的急性炎性反應是導致腦組織缺血損傷加劇的重要因素。而小膠質細胞在腦卒中發生后，會迅速活化并被募集至病變部位，是啟動腦缺血炎性反應的關鍵［11］。研究表明，活化后的小膠質細胞有兩種極化表型，分別為M1表型（促炎型）及M2表型（抗炎型）。而M1型小膠質細胞是神經炎癥反應的核心，M2型小膠質細胞具有抑制炎癥反應、促進組織修復等功能，在腦卒中后發揮神經保護功能［12］。

圖1 3組大鼠缺血側大腦皮層CD86／Iba1陽性細胞率比較（×400）

圖2 3組大鼠缺血側大腦皮層Arg1／Iba1陽性細胞率比較（×400）

圖3 3組大鼠缺血側大腦皮層IL-6蛋白表達比較（×400）

圖4 3組大鼠缺血側大腦皮層IL-4蛋白表達比較（n＝6）

圖5 3組大鼠缺血側大腦皮層NF-κBp65蛋白表達比較

CD86是M1型小膠質細胞的標記物，常被用來評估小膠質細胞M1型極化情況。在缺血性腦損傷中，IL-6作為M1型小膠質細胞釋放的神經炎癥因子之一，可導致神經元進一步受損［13］，通過檢測IL-6的表達，可反映M1型小膠質細胞的極化情況，評估大腦中的炎癥進程。Arg1作為M2型小膠質細胞的標記物［14］，在組織修復等過程中發揮關鍵作用。IL-4是M2型小膠質細胞釋放的抗炎因子之一，能減輕腦缺血／再灌注損傷后的炎癥反應［15］，可用來評估M2型小膠質細胞的極化水平。本實驗采用免疫熒光法將CD86、Arg1分別與小膠質細胞活化標志物Iba1共染，通過CD86、Arg1陽性細胞數與Iba1陽性細胞數的比值來觀察活化小膠質細胞的極化狀態；采用免疫組化法觀察大鼠缺血側大腦皮層IL-4、IL-6蛋白的表達情況。結果顯示：模型組較假手術組M1型小膠質細胞數和IL-6的蛋白表達明顯增加，而M2型細胞數和IL-4的蛋白表達明顯減少（P＜0.01），提示腦缺血／再灌注損傷后小膠質細胞異?；罨⑾騇1型轉化，介導神經炎癥反應；GLGZD干預后能明顯減少M1型小膠質細胞數和IL-6的蛋白表達，增加M2型細胞數和IL-4的蛋白表達（P＜0.01），提示GLGZD可促進活化的小膠質細胞向M2型轉化，從而減輕神經炎癥反應，促進缺血性腦卒中后的康復。

NF-κB是炎癥反應中發揮中心調控作用的關鍵因子，由p50和p65亞基組成，其中p65亞基在蛋白的C末端含有轉錄激活區域，可與胞核DNA上的κB序列結合位點特異性結合，從而啟動一系列基因的轉錄［16］，NF-κBp65的表達上調可促使小膠質細胞向M1型轉化［17］。本實驗采用Western blot檢測NF-κBp65蛋白表達水平，結果顯示，GLGZD能明顯減少缺血側大腦皮層中NF-κBp65蛋白表達水平（P＜0.01）。提示GLGZD可通過下調NF-κBp65蛋白的表達，調控小膠質細胞的極化，從而減輕腦缺血誘導的神經炎癥，發揮治療作用。