藤茶總黃酮固體脂質納米粒在大鼠體內腸吸收特性研究

張瑜倪，楊毛毛，張 瑞，林珠燦，郭素華

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

藤茶為葡萄科植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］的 嫩 莖 葉［1］，其味甘淡、性涼，具有清熱解毒、祛風濕之功效［2］。現代研究表明：藤茶中富含黃酮類化合物，其中，二氫楊梅素（又稱福建茶素）為其主要活性成分，其含量可達30%［3］。現代藥理研究表明：藤茶總黃酮具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抑菌消炎、保肝護肝、降糖降脂、改善胰島素抵抗等多種功能及對腦缺血再灌損傷的保護作用［4-7］。然而藤茶總黃酮中主要活性成分二氫楊梅素具有鄰三酚羥基結構，易被氧化，穩定性較差，有較低的水溶性和脂溶性［8-9］，且其穿透腸道黏膜的能力較差，體內半衰期短，口服生物利用度低等［10-11］，嚴重影響了體內藥效和臨床應用。

固體脂質納米粒（SLN）作為一種新型的藥物載體，可延長藥物的半衰期，進而提高藥效成分的生物利用度；同時具備降低毒性、改善藥物溶解性和生物相容性、提高穩定性及靶向性、緩釋控釋等特點［12-15］；此外，SLN可有效減少胃腸道環境對藥物的破壞，當小粒徑納米粒攜帶藥物經過胃腸道時，可以通過胃腸道及其淋巴吸收，減少肝臟首過效應［16］。基于前期藤茶總黃酮固體脂質納米粒的研制、處方的優化及體外釋藥行為的考察，本研究通過大鼠在體單向腸灌流實驗，考察了藤茶總黃酮原料藥和固體脂質納米粒在腸道不同部位的吸收情況。

1 材 料

1.1 試藥 藤茶總黃酮固體脂質納米粒凍干粉（課題組成員自制，批號：20181215，納米粒中二氫楊梅素含量為40.15 mg／mL）；藤茶總黃酮原料藥（課題組成員自制，批號：20180402）；二氫楊梅素（上海源葉生物科技有限公司，批號：160422，純度≥98%）；楊梅苷（北盈澤納新化工技術研究院，批號：15081713，純度為99.41%）；楊梅素（北京盈澤納新化工技術研究院，批號：15050810，純度為98.31%）；酚紅（北京索萊寶科技有限公司，批號：20060767）；甲醇為色譜純（德國Merck公司）；水為超純水；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、六水氯化鎂、無水氯化鈣、葡萄糖均為分析純。

1.2 儀器 BT100-1F蠕動泵（河北保定蘭格恒流泵有限公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州普森電子儀器廠）；LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、UV 3600紫外分光光度儀（日本島津公司）。

1.3 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠12只，體質量（220±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗前在福建中醫藥大學藥學院動物房適應7 d，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號：20170005005003。腸吸收實驗需大鼠體重增長至300～330 g。

2 方 法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer溶液的配制 稱量NaCl 7.80 g、CaCl20.37g、KCl 0.35 g、MgCl20.02 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.32 g、葡萄糖1.40 g（臨用前添加），加入適量蒸餾水溶解，并用1 mol／L磷酸溶液調pH值至6.8，加蒸餾水定容至1 L，備用。

2.1.2 酚紅溶液的配制 稱量20 mg酚紅粉末溶解于1 L的Krebs-Ringer溶液中，攪拌并混勻。

2.1.3 灌流液的配制 將藤茶總黃酮固體脂質納米粒凍干粉及其原料藥分別溶解于酚紅溶液中，得到濃度為48 mg／mL的2種灌流液。

2.1.4 混合對照品的配制 分別精密稱取一定量的二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素置于10 mL容量瓶，甲醇溶解定容，配制濃度分別為560.00、7.31、14.24μg／mL，4℃保存備用。

2.2 腸灌流液中酚紅濃度的測定

2.2.1 酚紅最大吸收波長的測定 取“2.1.3”項中含酚紅和藥物的灌流液，以及含酚紅Krebs-Ringer溶液各0.5 mL于試管中，加入0.2 mol／L NaOH溶液5 mL，搖勻，置于紫外分光光度儀400～700 nm下掃描（空白對照為0.2 mol／L NaOH溶液），測得酚紅的最佳吸收波長是559 nm。

2.2.2 標準曲線的配制 配制酚紅的標準溶液濃度依次為2.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0μg／mL，各取0.5 mL，再加入0.2 mol／L NaOH溶液5 mL，搖勻，在559 nm下測定并記錄其吸光度（空白對照為0.2 mol／L NaOH溶液），以吸光度（A）和濃度（C）分別為縱坐標和橫坐標繪制標準曲線，如圖1。

圖1 酚紅濃度測定的標準曲線

2.2.3 酚紅濃度的確定 將大鼠各腸段各時間點（每15 min收集1次）流出的腸灌流液樣品過濾，取續濾液0.5 mL，按照“2.2.2”項下的方法測得吸光度，按照標準曲線計算大鼠腸灌流液樣品中的酚紅濃度。

2.3 腸灌流液中總黃酮含量測定及方法學考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：TOPODS-AQ柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→80%A；20～30 min，80%A。檢測波長：二氫楊梅素為291 nm，楊梅苷與楊梅素為252 nm；流速：1.0 ml／min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.3.2 專屬性 分別取混合對照品溶液、空白灌流液（酚紅溶液）、藤茶總黃酮固體脂質納米粒灌流液及原料藥灌流液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，獲取譜圖。見圖2。

2.3.3 線性關系 精密吸取混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成系列濃度的對照品溶液。按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析。以對照品峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得到二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的線性回歸方程，結果見“3.1.2”。

2.3.4 精密度試驗 精密移取混合對照品溶液100μL置于2 mL離心管，加入200μL酚紅溶液和700μL甲醇，渦旋混勻，離心，取上清液按“2.3.1”項下色譜條件檢測。其中日內精密度為1 d內連續測定上清液6次，日間精密度為取上清液連續測定3 d，分別計算日內精密度和日間精密度的RSD。

2.3.5 穩定性試驗 按照“2.3.4”項同法制備上清液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積以計算RSD。

2.3.6 提取回收率試驗 精密移取混合對照品溶液500μL，分別置于6個10 mL容量瓶中，接著以含有酚紅、空白SLN的Krebs-Ringer溶液定容，混勻，則3個成分的濃度分別為28、0.37、0.71μg／mL溶液；精密吸取6個容量瓶中上述溶液各100μL，按照“2.3.4”項下方法處理得上清液，用HPLC測定，記錄峰面積為A1；另精密吸取6個容量瓶中上述溶液各100μL，加入900μL甲醇渦旋混勻，0.45μm濾膜過濾，用HPLC精密檢測，記錄峰面積為A2，計算回收率。公式為：

2.4 大鼠在體腸吸收試驗

2.4.1 在體單向腸灌流實驗模型的建立 將SD大鼠隨機分為藤茶總黃酮納米粒組、原料藥組，每組6只。取自由飲水條件下禁食12 h的大鼠，腹腔注射烏拉坦溶液5 mL／kg麻醉并固定，保持大鼠37℃的體溫，沿腹中線切開腹部約4 cm，尋找待分析腸段（十二指腸、空腸、回腸、結腸），在兩端剪口插管，結扎；先用37℃生理鹽水清洗腸道，排空；接著用37℃灌流液以0.2 mL／min的恒速灌注腸道，平衡30 min后開始計時，每15 min收集一次出口管的腸灌流液。灌注實驗結束后分別測量每段腸段的長度（L）和內徑（R），以計算相應灌流腸段的體積（V）與表面積（A），最后采用HPLC檢測出口管腸灌流液中的藥物濃度。

2.4.2 吸收參數的計算 小腸在吸收藥物的同時也吸收、分泌水分，致使灌流液體積發生變化，故計算腸吸收參數采用酚紅法。數據采用SPSS 28.0軟件分析。公式為：

ρin和ρout分別表示進出口待測藥物的濃度，ρ（PR）in和ρ（PR）out分別表示灌流液中酚紅（PR）在腸段進、出口的濃度，Q為灌流速度，A為所灌流腸段的面積，Fa為各時間段樣品中藥物的平均吸收分數，Papp為表觀通透系數。

3 結 果

3.1 灌流液中總黃酮含量測定及方法學考察結果

3.1.1 專屬性 如圖2所示，灌流液中其他雜質對二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素檢測無干擾。

圖2 各樣品的HPLC色譜圖

3.1.2 標準曲線的建立 二氫楊梅素的回歸方程：y＝25 908x＋37 417，r＝0.999 9，表明二氫楊梅素在11.2～560.00μg／mL線性關系良好；楊梅苷的回歸方程：y＝26 152x－3 612.5，r＝0.999 2，表明楊梅苷在0.15～7.31μg／mL線性關系良好；楊梅素的回歸方程：y＝45 234x－1 851.8，r＝0.999 5，表明楊梅素在0.28～14.24μg／mL線性關系良好。

3.1.3 精密度試驗 由表1和表2可知，日內、日間精密度平均RSD均小于3%，符合要求。

3.1.4 穩定性試驗 由表3可知，RSD結果在0.53%～2.77%內，符合方法學要求。

表1 灌流液中總黃酮日內精密度

表2 灌流液中總黃酮日間精密度（n＝6）

表3 灌流液中總黃酮穩定性（n＝6）

3.1.5 回收率試驗 由表4可知，二氫楊梅素提取回收率平均值為101.08%，楊梅苷為94.47%，楊梅素為97.80%，說明樣品的處理及檢測過程對3個成分的含量影響較小，符合要求。

3.2 在體單向腸灌流實驗結果 見圖3和圖4，結果顯示：總黃酮原料藥及納米粒在整個小腸腸段均有不同程度的吸收，在中上腸段的吸收尤其明顯，納米粒在4個腸段的平均吸收分數（Fa）和表觀通透系數（Papp）均高于原料藥。納米粒在十二指腸、空腸、回腸、結腸的Fa值分別為原料藥的1.89、2.07、1.47、1.84倍，在四個腸段的Papp分別是原料藥的1.80、3.02、1.65、1.95倍。經兩樣本t檢驗，與原料藥相比，納米粒在十二指腸、空腸的Fa有非常顯著升高（P＜0.01），在回腸和結腸明顯升高（P＜0.05），納米粒在空腸的Papp顯著升高（P＜0.05），而在其他3個腸段的Papp均無差異（P＞0.05）。

圖3 納米粒組及原料藥組總黃酮在不同腸段F a比較

圖4 納米粒組及原料藥組總黃酮在不同腸段P app比較

綜合平均吸收分數和表觀通透系數的結果來看，藤茶總黃酮固體脂質納米粒在空腸的吸收較好，其次是回腸、十二指腸、結腸；而總黃酮原料藥的最大吸收在回腸，其次是空腸、十二指腸和結腸，說明將藤茶總黃酮制備成固體脂質納米粒口服制劑，可增強總黃酮在腸道的吸收，甚至改變了最佳吸收腸段。

4 討 論

口服給藥是中藥最主要的傳統給藥方式，腸吸收是其最主要的吸收途徑。研究藥物口服后腸道的吸收情況對評價藥物的生物利用度、改進藥物的劑型、提高療效具有非常重要的意義［17］。本實驗采用在體實驗法，向大鼠腸道單向灌流藥物溶液，以評價藤茶總黃酮固體脂質納米粒及其原料藥在不同腸段的吸收。相較于外翻腸囊法，在體單向腸灌流能夠保證腸道神經和內分泌輸入的完整性，同時也保證血液和淋巴液的供應。藥物透過上皮細胞后被血液運走，避免了胃內容物、消化管固有運動等生理影響。

對照組藤茶總黃酮溶液在4個腸段的平均吸收分數和表觀通透系數均低于納米粒組，可能是因為總黃酮的水溶性差，被腸道吸收困難。而納米粒組的平均吸收分數和表觀通透系數均有所提高，推測可能與納米粒所帶電荷有關，帶負電荷的納米粒，具有較好的生物黏附特性，更容易透過腸道的粘液層，有效增加了其與腸道的接觸，從而以被動擴散或內吞的方式被小腸上皮細胞吸收。這需要通過Caco-2細胞攝取和轉運實驗進一步確證［18-21］。另一方面，制備固體脂質納米粒所用脂質載體和乳化劑的特殊性，以及制備過程中水油兩相混合乳化充分，再經過探頭超聲后減小粒徑，增強總黃酮納米粒的滲透性，從而能迅速穿過黏液層接觸腸細胞被吸收。

本實驗借助大鼠在體單向腸灌流模型，以酚紅作為指示方法來檢測比較納米粒制劑和其原料藥在體內不同腸段的吸收程度，該法穩定、可靠，實驗的可操作性強，可以普遍應用。經實驗考察發現，將藤茶總黃酮制備成固體脂質納米粒口服制劑，可增強總黃酮在腸道的吸收，甚至改變了最佳吸收腸段，即納米粒的最佳吸收腸段為空腸腸段，而原料藥為回腸。