二氫楊梅素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥的影響

管江麗，胡永紅，余 意，祁克明，魏藝聰，王瑞國(guó)*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢430000）

神經(jīng)炎癥是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特殊免疫應(yīng)答［1-2］，神經(jīng)組織中的許多促成因素，例如感染、腦外傷、藥物濫用、自身免疫或有毒代謝產(chǎn)物等都可能誘發(fā)神經(jīng)炎癥［3］。運(yùn)用中醫(yī)藥對(duì)神經(jīng)炎癥疾病進(jìn)行治療已逐漸成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）又稱雙氫楊梅素、蛇葡萄素等，是存在于蛇葡萄科蛇葡萄屬植物中的多酚羥基雙氫黃酮醇［4］。DMY已被證明可以預(yù)防阿爾茨海默病、帕金森病和抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病［5-7］。本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥小鼠模型，探究DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎癥的影響，以期為DMY新藥的開發(fā)以及相關(guān)疾病的治療奠定相應(yīng)的研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（SPF）級(jí)雄性C57BL／6J小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，合格證編號(hào)為SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物與試劑 二氫楊梅素（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S06J6L1）；脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：L2880）；Trizol裂解液（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號(hào)：R401-01）；HIF1抗體（美國(guó)Novus Biologicals公司，貨號(hào)：NB100-105）；p70S6K1抗體（美國(guó)Proteintech Group公司，貨號(hào)：14485-1-AP）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：K1622）、SYBR SELECT MASTER MIX試劑盒（貨號(hào)：4472908）均 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；S6抗體（貨號(hào)：4858）、p-S6抗體（貨號(hào)：2317）、p-p70S6K1抗體（貨號(hào)：9206）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號(hào)：P0012A）、BCA試劑盒（貨號(hào)：P0010）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)TECAN公司，型號(hào)：Nfinite M200 Pro）；電子天平（美國(guó)OHAUS公司，型號(hào)：EX224）；高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：Centrifuge5418）；基礎(chǔ)電泳儀（型號(hào)：PowerPac Basic）、凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc XRS）均購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

2 方 法

2.1 藥物配制 將50 mg DMY粉末溶解于50μL DMSO中（按照比例DMY∶DMSO＝1 mg∶1μL），配成1 mg／μL的DMY母液，置于冰箱于-20℃保存。使用前用0.9%生理鹽水將母液稀釋成1、2、4 mg／mL；將10 mg LPS溶解于10 mL 0.9%生理鹽水中，使其終濃度為1 mg／mL，置于冰箱于-20℃保存，使用前將其在常溫下溶解。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 60只C57BL／6J雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，低、中、高劑量組，每組12只。低、中、高劑量組按照10、20、40 mg／kg腹腔注射DMY，正常組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，1次／d，共7 d。

2.3 小鼠神經(jīng)炎癥模型的建立 末次給藥30 min后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各組小鼠后，將小鼠固定于腦立體定位儀上；剔除頭部毛發(fā)，常規(guī)消毒后，剪開0.5 cm的頭部皮膚，暴露出前囟，以前囟為原點(diǎn)，統(tǒng)一向下0.3 mm，向右旁開1.0 mm，深度為2.0 mm注射LPS（100μg／kg），注射速度為1μL／min，停針30 s使藥物擴(kuò)散；注射完后縫合切口，并在切口處涂慶大霉素以防止感染，放入籠中。

2.4 樣本采集 動(dòng)物模型建立24 h后，將各組小鼠脫頸處死，迅速斷頭取腦，去除小鼠嗅球、小腦和腦干后放入準(zhǔn)備好的凍存管中，置于液氮中保存；研缽高溫烘烤滅菌后，將腦組織在研缽里加液氮研成粉末；粉末按50、100 mg每管分裝到無菌無酶EP管中，放入液氮保存，備用。

2.5 RT-qPCR法檢測(cè)5組小鼠大腦中CD206 mRNA和CD14 mRNA的相對(duì)表達(dá)量情況 將各組分裝50 mg腦組織粉末的無菌無酶EP管置于冰上，加入1 mL Trizol裂解液提取總RNA，用移液槍吸取液體反復(fù)吹打，使組織能夠充分裂解；RNA定量調(diào)齊后，采用兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，再用SYBR Select Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR法檢測(cè)各基因的表達(dá)。基因引物見表1。

表1 用于RT-qPCR分析的基因引物

2.6 Western blot檢測(cè)5組小鼠大腦中S6／HIF 1信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平 將各組分裝100 mg腦組織粉末的無菌無酶EP管置于冰上，向每管加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和組織充分接觸裂解；用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)齊濃度，向樣品蛋白中加入適量5×Loading Buffer；震蕩器震蕩混勻，低速離心，放入干式恒溫器中100℃變性10 min；之后經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜到NC膜上，室溫5%脫脂奶粉搖床封閉2 h，漂洗后分別放入對(duì)應(yīng)的一抗溶液中冰盒搖床孵育過夜；之后用TBST溶液洗滌3次，每次10 min，再放入對(duì)應(yīng)的二抗溶液中室溫?fù)u床孵育2 h；TBST溶液洗滌3次，每次10 min；凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光，Image Lab軟件進(jìn)行分析處理，以目的蛋白的灰度和β-actin灰度的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（±s）表示，采用one-way ANOVA法分析。

3 結(jié) 果

3.1 5組小鼠大腦中CD206 mRNA和CD14 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 各組CD206 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，模型組低于正常組（P＜0.05），低劑量組與模型組比較無明顯變化（P＞0.05），中、高劑量組高于模型組（P＜0.05或＜0.01）；各組CD14 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，模型組高于正常組（P＜0.01），低、中、高劑量組低于模型組（P均＜0.01）。見圖1。

3.2 5組小鼠大腦中S6／HIF1信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的比較 各組P-S6／S6蛋白表達(dá)水平比較，模型組高于正常組（P＜0.05），低、中、高劑量組低于模型組（P＜0.05或0.01）；各組P-S6K1／S6K1蛋白表達(dá)水平比較，模型組高于正常組（P＜0.01），低、中、高劑量組低于模型組（P＜0.05或0.01）；各組HIF1蛋白表達(dá)水平比較，模型組高于正常組（P＜0.05），低、中、高劑量組低于模型組（P＜0.05或0.01）。見圖2、表2。

圖1 5組小鼠腦組織CD206 mRNA和CD14 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

圖2 5組小鼠腦組織S6／HIF1信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳圖

表2 5組小鼠腦組織S6／HIF1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較（±s）

表2 5組小鼠腦組織S6／HIF1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

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4 討 論

現(xiàn)多項(xiàng)研究證明中樞神經(jīng)炎癥與腦卒中、抑郁癥及多種慢性神經(jīng)退行性疾病如帕金森（PD）和阿爾茲海默癥（AD）等密切相關(guān)［8］。正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的炎癥反應(yīng)受炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞精密調(diào)控，侵入的病原體、有害蛋白等都會(huì)被清除，然而炎癥過度反應(yīng)會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)，如小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放各種炎癥介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、炎性趨化因子、一氧化氮等，它們過度積累產(chǎn)生的毒性會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、變性［9］。

細(xì)菌LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，它能致使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)。脂多糖受體（CD14）是主要的組織相容性復(fù)合物和趨化因子受體，是導(dǎo)致腦缺血在內(nèi)的腦疾病中神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要受體［10］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：LPS經(jīng)側(cè)腦室注射后，小鼠腦組織中的CD14 mRNA的表達(dá)量明顯增加，經(jīng)DMY給藥后，CD14 mRNA的表達(dá)量明顯降低，表明DMY能抑制CD14 mRNA的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用具有重要意義。在神經(jīng)炎癥反應(yīng)被激活后，小膠質(zhì)細(xì)胞存在M1（促炎因子）和M2（抑炎因子）兩種狀態(tài)：一方面，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD16、IL-6、TNF-α、IL-1β等標(biāo)記基因，進(jìn)一步惡化由炎癥引起的神經(jīng)損傷；另一方面，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD206、IL-10、TGF-β等標(biāo)記基因，抑制局部炎癥，減少神經(jīng)損傷［11］。LPS刺激會(huì)引起M1型促炎因子和介質(zhì)的大量表達(dá)以及M2型抑炎因子和介質(zhì)的表達(dá)抑制。而LPS誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥模型中，DMY上調(diào)M2型抑炎因子CD206 mRNA的水平，表明DMY可促進(jìn)神經(jīng)炎癥小鼠分泌抑炎因子。

為進(jìn)一步探討DMY的神經(jīng)保護(hù)作用，我們測(cè)定了S6k1／HIF1信號(hào)途徑相關(guān)蛋白，包括腦組織PS6K1、P-S6和HIF1蛋白表達(dá)水平。LPS刺激會(huì)引起P-S6K1、P-S6和HIF1蛋白表達(dá)水平升高，而DMY干預(yù)后P-S6K1、P-S6和HIF1蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)果表明：DMY能抑制S6／HIF1信號(hào)途徑的激活，證實(shí)了DMY在神經(jīng)細(xì)胞的存活及生長(zhǎng)過程中起著重要作用，能提升神經(jīng)細(xì)胞的存活率。

綜上所述，DMY能夠有效改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性神經(jīng)炎癥，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子的表達(dá)及S6k1／HIF-1信號(hào)通路有關(guān)。