釀酒酵母對木質纖維素水解液抑制物耐受性的研究進展

雷志鵬，孫曉仲，王撼宇，陳 歡，王 剛，張斯童，陳 光，孫 旸*

（1.吉林農業大學 生命科學學院秸稈生物學與利用教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；2.吉林省產品質量監督檢驗院，吉林 長春 130022）

纖維素燃料乙醇被認為是一種重要的化石燃料可再生替代能源[1-2]。二代纖維素乙醇是指以農作物廢棄物為原料，通過對原料進行預處理和纖維素酶解得到可發酵糖，經微生物發酵生產得到的乙醇，因其原料來源廣泛而受到關注。從20世紀初至今，纖維素乙醇技術的發展日漸成熟，然而距離實現大規模工業化生產仍然有一定的距離，尤其是木質纖維素水解過程中產生的多種抑制物對后續的酶解和發酵過程帶來的負面影響，是纖維素乙醇發展所面臨的瓶頸問題之一[3-4]。

由于木質纖維素原料內部結構成網狀緊密排列，組成復雜，木質纖維原料未經預處理時酶解得率不到20%，效率低而且非常緩慢。因此，預處理是釀酒酵母利用木質纖維原料發酵生產燃料乙醇必不可少的環節[5-7]。通過預處理，在一定濃度化學試劑、溫度、壓力下可有效破壞木質纖維素的致密結構，降低聚合度和結晶度，增加酶與底物的接觸面積，從而提高酶解效率[8]。然而木質纖維原料在預處理過程中，特別是在典型的稀酸預處理條件下，生物質原料會降解生成一系列結構復雜的抑制物（見圖1）。這些發酵抑制物的種類和濃度與原料和預處理條件密切相關，隨著抑制物濃度的增加，嚴重影響細胞活力和生長速度，延長生長延滯期，降低酶解和發酵過程中葡萄糖和木糖的轉化率[9-14]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為傳統生產乙醇的研究最廣泛的微生物，提高其對纖維素水解液中抑制物耐受性已成為當前燃料乙醇研究的熱點。近年來，研究者在釀酒酵母抵御水解液抑制物方面進行了研究探索，圍繞抑制物對酵母的抑制機理，代謝抑制物的生化途徑，以及構建抑制物抗性提高的酵母菌株等方面開展了一系列工作，取得了很大的研究進展。本文針對木質纖維素預處理水解液抑制物，綜述了其來源，抑制機理以及提高釀酒酵母對抑制物的耐受性方法，旨在為選育耐受性良好的釀酒酵母提供參考。

圖1 木質纖維素原料的組成及主要水解抑制物Fig.1 Composition of lignocellulosic biomass and main hydrolysis products

1 木質纖維素原料的預處理與發酵抑制物的形成機理

1.1 酸處理

木質纖維素酸預處理包括稀酸預處理和濃酸預處理兩種，為了避免設備腐蝕以及考慮酸的回收問題，稀酸預處理被認為具有更高的經濟可行。木質纖維素經稀酸預處理后，纖維素的平均聚合度下降，反應能力增強，影響稀酸預處理的因素主要包括酸濃度、溫度和反應時間[15-16]。與其他預處理方法相比，稀酸預處理方法使半纖維素以單糖形式的溶出率更高。然而，酸預處理過程中產生的己糖和戊糖會降解生成5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）和糠醛，進而降解成甲酸，乙酰丙酸等對后續發酵微生物有強烈抑制甚至有致死毒性的物質。隨著酸濃度的增大，水解液中抑制物的濃度也上升[17]。因此，為了降低這些抑制物對后續發酵過程的影響，木質纖維素水解液必須經過脫毒處理才能進入發酵階段[9]。

1.2 堿處理

與酸處理相比，堿處理可削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵，引起木質素和半纖維素間的酯鍵發生皂化，破壞木質素的結構，得到更高的木質素溶出率和較低的纖維素、半纖維素溶出率，此時與木質素連接的側鏈基團斷裂釋放出酚類物質，生成阿魏酸、香草醛、丁香醛等抑制物，其中一些低分子并且含有脂肪族官能團的的酚類單體抑制物對后續酶解和酵母的生長抑制作用最強[18-19]。丁馳等[20-21]對經過不同濃度的氫氧化鈉溶液預處理后的稻草秸稈水解液中抑制物成分進行了分析研究，較未經預處理的對照樣，經過堿預處理后的水解液中酚類和酸類抑制物種類明顯增多且分布非常集中，成為最主要的抑制物，且抑制物的含量也隨堿濃度上升而上升，其中以阿魏酸為主的酚類物質含量占絕對優勢。

1.3 蒸汽爆破處理

蒸汽爆破預處理可以顯著降低原料中半纖維素的含量和改變木質素的結構，提高纖維素酶的可及度，提高材料的酶解效率，是一種應用前景十分廣闊的預處理方法。然而，在高溫高壓或化學物質催化作用下，同時伴隨有許多副反應發生，半纖維素部分過度降解，產生乙酸、糠醛等發酵抑制物[22]。汽爆條件的不同，對不同材料的酶解效率以及抑制物生成的影響程度也不同，影響因素包括蒸汽爆破壓力、溫度、時間等[23-25]。王風芹等[26]采用不同的蒸汽爆破條件對玉米芯進行預處理，研究了蒸汽爆破玉米芯中的有毒物質含量，結果表明隨著蒸汽爆破強度的增強，半纖維素水解的低聚糖進一步被分解破壞，甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF和總酚的含量顯著增多。

2 抑制物的種類和作用

2.1 酸類物質

木質纖維素水解液中的酸類毒性副產物主要包含甲酸和乙酸，甲酸是由糠醛和5-HMF進一步降解形成的，而乙酸則主要是在半纖維素中的乙酰基裂解之后生成的，其中乙酸的濃度相對較高。對于弱酸類物質對微生物的抑制機理，一般認為甲酸和乙酸都屬于酸性弱電解質，纖維素水解液通常為弱酸性，pH值低于甲酸和乙酸的酸度系數（pKa）值，使得兩種物質呈現未解離的小分子狀態，可通過細胞膜進入細胞內部；當弱酸進入接近中性的細胞質環境后，甲酸和乙酸分子開始解離，形成酸根離子（RCOO-）和氫離子（H+），由于胞內H+大量積累，引起細胞質酸化[27]，破壞細胞的跨膜電勢，降低代謝活性。同時為維持正常的生長環境，細胞會激活細胞膜上的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶，通過水解ATP獲得足夠能量驅動質子泵，從而排出H+。由于ATP大量消耗而又得不到及時的補充，用于細胞代謝的ATP就會供應不足，細胞生長一些必需的酶，輔酶以及一些營養物質得不到及時的供應和運輸，從而導致細胞活性降低，并最終影響微生物的發酵過程[28]。

2.2 醛類物質

糠醛和5-HMF是水解液中兩種主要的醛類毒性抑制物，其中糠醛主要是由木糖、阿拉伯糖等戊糖脫水環化形成，而5-HMF則主要是由葡萄糖、甘露糖等己糖脫水生成。糠醛和5-HMF對微生物的抑制機理相似，但糠醛對細胞生長和代謝的抑制作用較5-HMF更強，通常會抑制細胞糖酵解和三羧酸循環等重要碳代謝過程中相關的酶（如己糖激酶，乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶等）活性，降低細胞的比生長速率，同時可降低乙醇得率和產率[29-30]。此外，進入細胞的醛類抑制物還會導致活性氧含量的上升，引起線粒體，核染色體的損傷。雖然微生物自身可將糠醛和5-HMF還原為糠醇、羥甲基糠醇等毒性較小的物質來減少醛類抑制物對自身的影響，但這個轉化過程需要消耗大量的ATP，同時會使細胞內的還原力水平降低，還與乙醛共同競爭乙醇脫氫酶，從而延遲酵母代謝活動，抑制乙醇生成[31-32]。糠醛和5-HMF也可與脂肪酸類抑制物產生協同效應降低酵母的生理性能和發酵性能[33]。

2.3 酚類化合物

酚類物質主要來源于木質素的降解，主要包括以阿魏酸和香草醛為代表的酚類抑制物，雖然這些酚類抑制物在纖維素水解液中的濃度很低，但它們對微生物的毒性作用卻很大。有關酚類化合物對微生物的抑制機制還沒有完全闡明，一般認為酚類化合物可滲透到細胞膜內，引起細胞活性氧的積累，而且可通過改變細胞膜蛋白和脂質的比例，引起細胞膜的不可逆的損傷來影響細胞正常的生長，且分子質量和酚單體上取代基的位置也影響酚類物質的毒性[34-35]。

3 提高釀酒酵母對抑制物耐受性的方法

為了降低纖維素水解液抑制物對后續酶解以及釀酒酵母發酵的影響，并提高乙醇的生產效率，水解液抑制物的脫毒處理是常用的方法之一。但是脫毒處理工序往往會造成水解液中糖類的損失以及增加纖維素乙醇發酵的成本。因此只有提高發酵菌株的抑制物耐受性，使其適應未脫毒的水解液環境，才能從根本上解決水解液抑制物對酵母產生的毒害影響。通過菌種篩選，誘變育種，基因工程改造以及長期適應性馴化是提高釀酒酵母對水解液抑制物耐受性得到有效措施。

3.1 自然選育

發酵菌種的自然選育就是從自然或者工業環境當中收集微生物，篩選，鑒定對抑制劑具有高抗性的菌株。采用傳統分離篩選的方法簡單實用，目前仍是篩選高耐受性酵母菌株的有效方法之一。FAVARO L等[36]從釀酒廠葡萄渣里篩選到40株釀酒酵母菌株，并對這些菌株進行了脂肪族羧酸、呋喃醛以及含有混合抑制劑的甘蔗渣水解液的耐受性評價，發現這些菌株的發酵能力和抑制物抗性均大于普通的工業和商業釀酒酵母菌株。WIMALASENA T T等[37]從自然環境、葡萄酒廠、啤酒廠等篩選到了90株釀酒酵母菌株，并就目前木質纖維素水解液乙醇發酵過程中的一些脅迫條件（高溫、高滲透壓、高乙醇濃度和抑制物）做了表型評價，發現許多菌株對多種抑制劑具有耐受性。

3.2 誘變篩選

纖維素水解液中的多種抑制物對細胞的毒害作用機理是非常復雜的，很多基因在細胞中作用機制以及作用靶點尚不清楚。誘變及篩選是一種傳統的菌種選育手段，具有簡便、快捷、高效等特點，因此一直是菌種選育普遍使用的方法之一[38]。陳勝杰等[39]以釀酒酵母XP為出發菌株，通過常溫等離子誘變技術，得到突變體庫，并以玉米秸稈水解液為篩選壓力，經過多代連續傳代，梯度增加抑制物濃度，馴化培養突變株，最終篩選出能夠在玉米秸稈水解液中高產酒精的改造菌XP2，其生長性能優勢明顯，轉化糠醛和乙酸的能力較原菌有明顯提升；董健等[40]以釀酒酵母AY12為出發菌株進行紫外誘變獲得突變群體，再與釀酒酵母反復產孢與雜交篩選得到最優菌株LYQ-F1；郭雪嬌等[41]通過誘變育種結合馴化工程選育了一株具有對復合抑制劑高耐受性的釀酒酵母XYJ003，在未脫毒的秸稈纖維素水解液中發酵，乙醇產量達到4.16 g/（L·h），而對照菌株無乙醇產出。林貝等[42]以釀酒酵母Sc4126作為出發菌株，在2 g/L糠醛、5 g/L乙酸、1 g/L香草醛組成的復合抑制劑存在下進行紫外誘變篩選，而后逐漸提高復合抑制劑濃度進行馴化，發酵對比實驗結果顯示其在復合抑制劑中的耐受性有效提高，在復合抑制劑存在下，優勢菌株Sc4126-1發酵時間為48 h，乙醇平均產率0.19 g/（L·h），而原始菌株Sc4126發酵時間138 h，乙醇平均產率0.06 g/（L·h），相比原始菌株，優勢菌株發酵時間縮短65.22%，乙醇平均產率提高2.17%。

3.3 基因工程改造

基于不同微生物對環境脅迫耐受能力的差異及轉錄組學和蛋白表達分析的基礎上，挖掘新的靶點基因和代謝通路，進行過表達是強化酵母耐受力的有效手段之一。通過過表達相關代謝關鍵酶蛋白，可開發出對木質纖維素水解抑制物具有更好抗性和代謝能力的重組微生物。基因工程改造方法針對性和目的性強，隨著對細胞耐受機理的分析，相關基因改造策略和合理的基因線路已經被成功設計去強化菌株對單一抑制劑和混合抑制劑的耐受性。張克俞等[43]在硫酸鋅添加條件下轉錄組分析揭示其與轉錄調控、碳水化合物代謝、核苷酸代謝及氨基酸代謝等途徑相關基因的變化，篩選分析可能關鍵基因ADE17、SSZ1、SET5、PPR1、OGG1和YKL222C過表達對釀酒酵母環境脅迫耐受性的影響，同時發現這些基因過表達不僅提高了酵母乙酸耐受性，而且賦予了其應對其他多種脅迫的耐受性（糠醛、苯酚、丙酸）；吳宇等[44]以原始酵母菌BY4741為出發菌株，通過表達釀酒酵母自身的谷氨酰胺合成酶基因GLN1，成功構建了重組菌株YEA9，使得胞內谷胱甘肽抗氧化系統的水平得到提升，進而降低釀酒酵母中活性氧的含量，從而增強了釀酒酵母的耐受糠醛脅迫能力和乙醇發酵速率，最終乙醇濃度提高了9.2倍；細胞膜蛋白具有物質運輸，細胞識別以及細胞防御等多項功能，向瑞娟[45]利用基因工程改造相關手段將膜轉運蛋白基因ADP1，MDRI過表達于釀酒酵母S.cerevisiae280/959，并通過甲酸，乙酸，糠醛等抑制物脅迫條件下，進行生長情況比較和發酵性能考察，結果表明過表達菌株較對照菌株表現出一定的抗性，在生長速率，糖耗速率，乙醇產率等方面有明顯的優勢；LUO P等[46]研究發現來自耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）RI的IrrE調控基因的異源表達不僅賦予了釀酒酵母對單一或者多種抑制劑（糠醛、5-HMF、甲酸和乙酸）更好的耐受性，而且增強了其對活性氧的清除能力，使得菌種在乙醇、酸、滲透壓等多重壓力下仍然保持旺盛的生長和代謝活力。

3.4 適應性馴化

進化工程是開發用于工業生產燃料和化學品的高性能酵母菌株的一種有效手段，通過模擬自然進化中的生物變異和選擇過程，在人工提供選擇壓力的條件下使微生物進化，然后從進化的菌群中篩選出性狀優良的菌株[47-48]，它可以加速酵母基因組和特定基因的體內突變率獲得表型穩定的菌株。TIAN S等[49]在軟木水解液中對S.cerevisiaeY5進行了適應性馴化，通過提高水解液抑制物濃度的方法，將對數生長期的釀酒酵母逐漸轉移到新的適應環境，直到能夠在未稀釋的水解液中穩定連續傳代培養，結果顯示馴化之后的釀酒酵母對1～4 g/L不同質量濃度的糠醛和5-HMF都有很高的耐受能力。HAWKINS G M等[50]以一株工業酵母菌株XR122N為基礎，利用松樹水解液進行連續傳代馴化得到菌株AJP50，結果表明菌株AJP50很明顯地縮短了發酵延滯期，可以快速地將糠醛和5-HMF轉化為低毒性的醇類衍生物，從而減少了細胞內活性氧對細胞的毒害作用；QURESHI A S等[51]通過將S.cerevisiaeDQ1每隔12 h，依次轉移到含有抑制物的玉米秸稈水解液中進行適應性馴化，最終在65 d的連續適應后獲得穩定的酵母菌株，適應性酵母菌株在30%的固體含量下，發酵得到71.40 g/L的乙醇含量和80.34%的乙醇產率，顯著地改善了酵母的發酵性能。LI W C等[52]以可利用木糖發酵的S.cerevisiaeE7為出發菌株，將其在濃度從40%～100%不斷提高的含有復合抑制劑的培養基中進行馴化，最終得到的馴化菌株S.cerevisiaeE7-403縮短了延滯期，更有效地去除了糠醛對酵母生長和發酵的影響，增強了對混合糖的利用和乙醇得率。

4 展望

利用木質纖維素作為原料生產燃料乙醇，是實現由傳統化石能源到清潔型能源轉變的重要發展方向。釀酒酵母因其獨有的乙醇產率高，耐受性好的特性，這使得其廣泛用于燃料乙醇的工業生產，但是距離纖維素乙醇能夠大規模地商業化應用仍然有眾多瓶頸問題亟需解決。

目前，利用釀酒酵母進行乙醇發酵主要以下幾個問題；①釀酒酵母不能利用半纖維素水解產生五碳糖；②釀酒酵母生長和乙醇生產受預處理副產物和發酵物的抑制；③釀酒酵母高溫、高糖濃度發酵性能不佳。盡管在增強菌體對纖維素水解液中戊糖的利用以及單一環境壓力的耐受性和作用機制方面已有了較多的研究，但是選擇和育種抗多重應力的工業酵母是仍當前研究的重點。此外，目前還缺少工程菌株在纖維素生物質水解液發酵實際應用過程中的評價和放大研究。隨著對抑制物形成，作用機制及釀酒酵母耐受機制的研究不斷深入，構建本身具有抑制物代謝活性的工業發酵菌株，將菌株的代謝能力提升和耐受能力強化進行耦合是未來解決木質纖維素水解液抑制物問題的理想手段，但是微生物對抑制物的耐受和代謝是一個復雜的調控體系，目前對抑制物代謝及耐受的基因背景尚未清晰了解，針對復雜的抑制物環境，利用基因工程和代謝工程定向改造微生物受到限制，另一方面，不同預處理方法的處理效果跟原料的組分也有很大的關系，因此，在木質纖維素深加工過程中，應根據原料的類型探索合適的預處理方式，以減少抑制物的產生和環境污染，提高整體的生產效率和經濟性。

綜上所述，加強釀酒酵母對木質纖維素乙醇發酵過程中的研究和評價，進行菌株構建和優化，進一步提高纖維素乙醇生產的高效性和經濟性，是未來酵母菌株選擇的重要研究方向。面對乙醇生產工業復雜的環境，只有提高釀酒酵母對多種環境壓力脅迫下的耐受性及發酵效率才是未來能夠大規模高效利用木質纖維素水解液的關鍵。