清香型白酒釀造微生物和風味物質的研究進展

田德雨，閆子茹，危晶晶，關軍鋒，趙國群，，劉金龍，*

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

白酒是中國傳統發酵食品，是世界著名的六大蒸餾酒之一。其是以谷物為原料、酒曲為糖化發酵劑，采用雙邊或固態糖化發酵生產的酯香濃郁的蒸餾酒[1]。原料、酒曲類型、釀造工藝和自然環境等因素決定著白酒的風格，目前已有清香型、濃香型、醬香型、米香型等12種白酒香型。其中清香型白酒被視為中國白酒的起源，曾經全國市場占有率在75%左右，截至目前，清香型白酒仍有很大市場，主要集中于中國北方等地區，因其具有“清香純正、一清到底”的特點而深受消費者歡迎。中國白酒的風味特征的形成主要是因其種類、數量眾多的微生物生長、代謝形成的產物和各種微生物種間的相互作用、相互影響產生多種具有特殊風味的化合物。這些微生物遍布于整個發酵體系中，各類微生物彼此相互交織、相互作用，構成了獨特釀造微生物體系，也可稱之為白酒釀造微生態。不同香型的白酒具有各自的獨特風味特征是因其釀造中的微生態組成存在差異。而清香型白酒釀造中微生態的形成主要以大曲微生物、酒醅微生物為主，環境微生物為輔。清香型白酒正是因為其獨特的釀造過程中微生態體系形成了“清、正、甜、凈、長”的風味特征。為了更加全面的了解清香型白酒，本文對近年來清香型白酒的釀造工藝、釀造微生物、風味物質的研究現狀進行闡述分析，以期為今后清香型白酒的理論研究及釀造技術的發展提供參考。

1 清香型白酒釀造工藝

清香型白酒主要釀造原料是高粱，不同高粱品種的支鏈淀粉、粗蛋白、粗脂肪等物質含量及其物理特性都有較大差異，高粱的質量決定著白酒的品質[2]。清香型白酒釀造工藝主要包括潤糝、發酵、蒸餾等過程。首先選擇質量上等的高粱和輔料進行“清蒸”處理，添加以大麥和豌豆混制的三種低溫大曲為糖化發酵劑，首次蒸餾后的酒醅只加入大曲進行二次發酵，蒸酒結束后丟棄酒醅。清香型白酒的釀造工藝特點可歸納為“清蒸清燒、地缸發酵、清蒸二次清”[3]，該工藝賦予了清香型白酒清香純正、醇甜柔和、余味爽凈的風味特征，杏花村的汾酒為該香型的典型代表。清香型白酒釀造工藝如下：

“曲乃酒之骨”，大曲發揮著糖化劑、發酵劑、酒化劑和生香劑[4]的作用。曲作為糖化發酵劑是白酒固態發酵最主要的動力，其主要作用是將原料中的淀粉物質轉換成糖[5]，以供給微生物進行酒精發酵。原料、曲房等環境中的微生物在曲坯（淀粉質原料）上富集，經過擴大培養后會形成各種有益的釀酒微生物菌系和酶系，再經風干和貯藏處理制得即成為成品大曲[6]。各類微生物在釀造過程中產生大量的代謝產物，這些物質賦予大曲白酒獨特的風格特征[7]，我國眾多名優白酒大多是采用大曲釀造而成的。

清香型為代表的汾酒是采用以大麥和豌豆為原料制得的三種中低溫大曲（清茬曲、后火曲和紅心曲），將其按照比例（一般為3∶3∶4）混合使用，其中清茬曲中酵母種類、曲霉多于其余2種曲，紅心曲和后火曲中嗜熱的放線菌和芽孢桿菌的數量較多。中、低溫大曲的差別之處在于制曲溫度，清茬曲是中溫大晾（頂溫約40 ℃），其具有曲清香；后火曲是大熱大晾（頂溫約45 ℃），其具有曲清香、炒豌豆香；紅心曲是多熱少晾（頂溫為40～45 ℃），其具有曲香味。清香型制曲工藝流程如下：

大麥、豌豆→粉碎→拌和→踩制→入房→上霉→晾霉→潮火→大火→后火→養曲→貯曲→成品曲

不同于濃、醬香型的窖池發酵，清香型白酒的釀造過程是在地缸容器中進行糖化發酵及酒精發酵。清香型白酒釀造最關鍵的兩個控制指標是入地缸的溫度和水分，均一性好的發酵酒醅才能保證發酵過程的正常進行。水分是白酒固態發酵主要控制指標，酒醅水分適宜并均一，能有效激活大曲中各類酶系的酶活，同時也可以保證發酵體系中各類釀酒微生物的生長及代謝所需，從而保障白酒正常的品溫變化規律[8]。溫度是影響釀酒微生物生長代謝重要的因素之一。適宜的入缸溫度可以保證微生物在發酵過程中的能有序生長及代謝，使白酒發酵過程符合“前緩、中挺、后緩落”的品溫變化規律。發酵過程中酒醅溫度是決定白酒產量和質量的關鍵因素，酒醅溫度受地缸所處環境溫度、酒醅入缸時初始溫度和微生物的代謝強度的影響[9]。只有控制好溫度和水分的關系，微生物才能進行正常的生長代謝，將原料中的淀粉、糖類等物質轉化為白酒的風味物質，從而提高白酒的品質。

2 清香型白酒釀造微生物

2.1 微生物鑒定的研究進展

中國釀酒史傳承久遠，對于釀造過程中微生物的認識與研究一直是研究熱點。平板純培養法是將微生物進行分離純化培養，觀察顯微鏡下形態，并根據生理生化特征進行鑒定，其適用于可培養的微生物，而發酵環境中絕大部分是未培養微生物，因此無法真正了解微生態的整體[10]，無法分析微生物菌群間的相互作用。隨著生物技術的發展，磷脂脂肪酸分析方法（phospholipid fatty acid，PLFA）、基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的指紋圖譜分析、基因測序及系統發育分析、克隆文庫、熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）、宏基因組學、蛋白組學、代謝組學等[10]研究方法的出現，大力推動了白酒微生態學的發展。

PLFA廣泛用于研究微生物復雜的群落關系及其動態變化規律。不同微生物種屬的PFLA結構及種類有一定的異同，所以可作為微生物標記物不僅能應用于研究微生物的群落結構，也可用于微生物菌株的輔助鑒定[11]?；赑CR的指紋圖譜分析技術是目前白酒釀造微生物中常用的技術，是通過比較脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）指紋圖譜中的條帶剖析樣品中微生物的群落組成以及多樣性，包括變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）等[10]，其中最常用的是PCR-DGGE技術。高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）又稱為“下一代”測序技術（next-generation sequencing technology，NGS），該技術一次最多能并行測定幾百萬條DNA分子序列，并且讀長較短，能夠深入、細致、全貌的分析一個物種的轉錄組和基因組[12]，常用的測序平臺有Solexa、SOLiD和454等?；蛭膸焓菍δ繕藰悠分形⑸锝⒒蛭膸?，通過測定文庫中的基因序列，進而得到樣品中所含微生物的基因種類和相對數量，其中最常用的是細菌16S rDNA基因克隆文庫、真菌18S rDNA基因克隆文庫以及真菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）基因克隆文庫。最年來應用上述技術對清香型白酒釀造微生物的研究如表1所示。

表1 清香型白酒釀造微生物的研究現狀Table 1 Research status of brewing microorganism of light-flavor Baijiu

續表

2.2 釀造微生物的組成

清香型白酒釀造所采用地缸容器進行固態發酵，是區別于濃、醬等香型的窖池發酵的特殊之處，故形成其清香純正、一清到底的風格特征。在清香型白酒釀造過程中所形成的微生態是以大曲微生物和酒醅微生物為主、環境微生物為輔，其中以酵母菌、霉菌、細菌及放線菌菌屬為主的各類微生物遍布于整個固態發酵體系中，彼此相互錯、相互作用、相互影響，其中酵母菌主要有酒精酵母、產酯酵母、假絲酵母等；霉菌有曲霉、根霉、毛霉、青霉、紅曲霉等；細菌主要有乳酸桿菌、醋酸菌、丁酸菌等。

2.2.1 大曲微生物

大曲是由大麥和豌豆等為原料經粉碎制塊和自然接種而制成，大曲是白酒發酵的“動力”，這是因為大曲中含有多種微生物群落，這些微生物來自原料和發酵環境。在制曲過程中，微生物經歷了適應、增殖、平衡和衰退等環節，形成多種微生物組成的穩定菌群。大曲中的微生物大致分為酵母菌、霉菌、細菌和少量放線菌。大曲的研究集中在微生物群落結構[30]和功能性微生物[31]兩方面。

酵母菌主要有釀酒酵母、產酯酵母、假絲酵母等，釀造過程中起酒化與酯化作用[32]。酒精酵母是白酒釀造中主要的產酒功能菌，釀酒酵母、漢遜酵母分泌的酒化酶能將葡萄糖經糖酵解途徑生成乙醇。產酯酵母主要是假絲酵母和漢遜酵母，具有很好的酯合成能力和生香功能，將糖、醛、酸和鹽類作為底物轉化合成具有果香的酯類物質[33]。雷振河[20]通過高通量測序技術分析清香型白酒釀造微生物，研究結果表明，曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬實清香型大曲優勢真核微生物，其中曲霉菌和根霉菌在釀造過程其糖化作用。周森等[21]應用高通量測序技術解析清香型大曲微生物，研究結果發現酵母菌8種分別為扣囊覆膜酵母、庫氏畢赤酵母、熱帶念珠菌、白地霉、菱形伊薩酵母、異常漢遜酵母、阿薩希絲孢酵母、釀酒酵母。王薇等[34]對運用WL鑒別培養基和26S rRNA D1/D2序列分析方法對清香型白酒三種典型大曲進行研究，結果發現：清茬、紅心、后火曲具有相同的優勢菌種扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），但三者酵母結構組成差異較大，清茬曲中酵母菌的種類和數量最多。

霉菌在糖化力、酯化力、液化力方面發揮著重要作用，霉菌決定大曲質量。酒曲中霉菌主要是曲霉、根霉、毛霉、犁頭霉、青霉等，霉菌菌落形態較大，常見的菌落生長初期為白色或灰白色，隨后會形成大量孢子呈現不同顏色[35]，常以霉菌顏色作為大曲質量的感官評定的依據[36]。不同霉菌的代謝產物不同，其發揮的作用也有所差別。如根霉分泌的糖化酶和淀粉酶可以將淀粉充分分解成葡萄糖，其中米根霉具有高產糖化型淀粉酶的能力[37]，通過破壞淀粉中的糖苷鍵，將淀粉轉換更多的發酵性糖類。黑曲霉可產生α-淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、β-葡萄糖苷酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、果膠酶等[38]；紅曲霉能產生酯化酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶、糖化酶等[39]；這些酶類可以促進酸、酯的形成，使白酒具有獨特香味。周森等[21]應用高通量測序技術解析清香型白酒的大曲微生物，研究結果發現5種絲狀真菌分別為米曲霉、謝瓦散囊菌、微小根毛霉、嗜熱子囊菌、傘枝橫梗霉。

大曲中的細菌種類繁多，常見的細菌有醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等，它們在發酵過程中可以迅速代謝產生各種呈香呈味物質或者是其前體物質。如適量醋酸菌參與代謝形成酯類物質，但醋酸菌過量時，抑制酵母生長，并產生刺激性酸味對白酒品質產生負面影響。乳酸菌可代謝產生乳酸、乳酸乙酯等物質，乳酸含量的多少能夠直接影響白酒質量。ZHENG X W等[40]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術從汾酒大曲中分離并鑒定出109株細菌，主要是法國乳桿菌、產氣腸桿菌和大型芽孢桿菌等。ZHANG HX等[13]研究發現，清茬曲和后火曲中細菌所占比例均高于紅心曲，并推測是由于紅心曲中存在紅曲霉導致；同時發現部分細菌會影響白酒酸度和出酒率。雷振河[20]通過高通量測序技術分析清香型白酒釀造微生物，研究發現大曲微生物構成中原核微生物的復雜程度高于真核微生物，其中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和酸酐菌門是清香型大曲優勢原核微生物。周森等[21]研究發現，清香型大曲微生物主要包括乳桿菌目、芽孢桿菌目、紅螺菌目、腸桿菌目、假諾卡氏菌目、鏈霉菌目。

2.2.2 酒醅微生物

酒醅中微生物的群落演替與清香型白酒的風味有直接關系，通過微生物之間的共同發酵，彼此之間的共生、消長和代謝互補等作用影響著清香型白酒獨特風味物質的形成[41]。酒醅微生物主要是以原料、大曲和釀造所處環境微生物為主，經過長期自然馴化使酒醅形成特定的微生物菌落群體，主要由霉菌、酵母菌和細菌構成，其中酵母菌類中主要有酵母菌屬、擬內孢霉、漢遜酵母和假絲酵母；霉菌類中主有梨頭霉、黃米曲霉、根霉、毛霉和紅曲霉；細菌類中主要有乳酸菌、醋酸菌、芽殖桿菌（革藍氏陽性）和革藍氏陰性芽孢細菌[42]。

雷振河[20]采用高通量測序技術分析了清香型白酒酒醅微生物，結果表明醋酸桿菌科和乳桿菌科是優勢原核微生物，占原核微生物70%以上；假絲酵母和畢赤酵母科是酒醅中真核微生物絕對優勢菌。童敏江等[43]對分離自不同時間段酒醅的菌株進行了發酵試驗，根據主要代謝產物的種類與產量確定了四類功能菌株：乙醇功能菌株包括酵母屬、卵胞酵母屬、克魯氏酵母、固囊酵母屬、漢遜氏酵母屬或擬內酵母屬；產乙酸乙酯的功能菌主要屬于卵胞酵母屬、畢赤酵母屬和固囊酵母屬的菌株；乳酸和乙酸高產菌株多屬于芽孢桿菌屬，少數屬于乳酸桿菌屬、棒狀桿菌屬和芽孢乳桿菌屬。賈麗艷等[44]利用Illumina MiSeq 高通量測序技術，對傳統清香型白酒大米查和二米查發酵過程中的細菌群落結構、豐度及演替規律進行研究，結果表明，大米查和二米查細菌群落組成豐富，主要優勢菌群包括葡萄球菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬；它們動態變化，此消彼長，影響大米查和二米查酒的質量與風味物質的產生。

3 清香型白酒風味物質的研究現狀

白酒風味物質最開始是通過化學分析方法對總酸、總酯含量的進行測定。隨著科學進步，高效便捷的研究方法和設備逐步應用于白酒風味化合物的研究中，如頂空-固相微萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）、液液微萃取法（liquid-liquid microextraction，LLME）氣-質聯用（gas chromatogramphy-mass spectrometry，GC-MS）技術、氣相色譜-嗅聞儀（chromatography-olfactometry，GC-O）聯用技術、二維或多維氣質聯機（multi-deans switching gas chromatogramphy-mass spectrometry，MDGC-MS）技術等。目前對于白酒風味物質的研究中頂空-固相微萃取法、浸入式固相微萃?。╠irect immersion solid-phase microextraction，DISPME）、LLE是運用最多的香氣提取方法，GC-MS、MDGCMS和GC-O是應用最普遍的風味物質鑒定技術。季克良等[45]首次將全二維-飛行時間質譜儀（comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）引入白酒風味化合物分析領域，從清香型白酒中鑒定出178種化合物。杜艷紅等[46]采用DI-SPME、LLE前處理方法結合GC-MS定性手段，在紅星二鍋頭酒中鑒定出138種化合物。范文來等[47]應用LLE樣品處理方法結合色譜和GC-MS技術從清香型汾酒和醬香型郎酒中共鑒定出698種風味化合物。杜靜怡等[48]利用液液萃取、頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜-嗅聞聯用儀對清香型志都五谷酒香氣活性成分進行分析。冒德壽等[49]應用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法（HS-SPME-GC-MS）從5種清香型白酒中鑒定得到72種香氣化合物，并利用氣相色譜嗅覺測量技術（GC-O）結合香氣強度分析法（Osme）對其進行嗅聞分析。結果得到35種重要香氣物質（Osme）≥2，具有香氣貢獻的化合物共18種。

白酒中約有98%（質量分數）是乙醇和水，而醇、醛、酸、酯類等微量成分約占2%（質量分數）。微量成分以一定量比關系存在于酒體中，彼此互相配合、補充、襯托和制約，從而形成多種白酒風格[50]。清香型白酒中的酯類物質以乙酸乙酯、乳酸乙酯為主，二者的含量及比例關系影響清香型白酒的質量和風格[51]，二者比值約為1.25～1.67，超過這個比值，則影響清香型白酒的口感，使酒體失去平衡[52]。地缸發酵是香氣產生的最關鍵環節。酯類化合物是白酒香氣組成的主要物質，由部分酸和醇發生酯化反應產生，它們大部分是生香酵母、霉菌和細菌的胞內代謝產物，其中酵母菌和霉菌都對產酯起到促進作用[26]。杜靜怡等[48]利用液液萃取、頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜-嗅聞聯用儀對清香型志都五谷酒香氣活性成分進行分析，結果發現，通過香氣提取稀釋分析法從五谷酒中得到40種香氣物質，香氣稀釋因子由大到小依次為異丁酸、月桂酸乙酯、愈創木酚和2-苯乙醇；結合香氣稀釋（flavor dilution，FD）因子與香氣活性值（odor activity value，OAV）貢獻，乙酸異戊酯、3-苯丙酸乙酯、愈創木酚、異丁酸、月桂酸乙酯、3-甲硫基丙醇、乙酸乙酯、2-苯乙醇和3-甲基丁醇是對五谷酒香氣有重要貢獻的化合物。郝飛龍等[53]采用氣相色譜、頂空固相微萃取/液液微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術從不同酒樣中確定了59種香氣成分，并計算其氣味活度值（OAV），確定出具有香氣貢獻的化合物（OAV≥1）共31種，其中屬于重要的香氣組分（OAV≥10）17種。姜曉坤等[54]采用頂空固相微萃取技術分析高粱酒中的香氣成分，其中主要香氣成分為乙酸乙酯、3-甲基丁醇、丁酸乙酯、己酸乙酯。

4 展望

清香型白酒在釀造過程中所形成的的微生態，即大曲微生物、酒醅微生物以及環境微生物的相互作用、相互影響產生具有獨特風味物質的化合物，使之具有“清、正、甜、凈、長”的特點，“清香純正、一清到底”是清香型白酒區別于濃、醬或其他香型白酒的特征。本文從釀造工藝、釀造微生物和風味物質對清香型白酒的研究現狀進行了總結分析，旨在為清香型白酒的研究提供參考。

對未來清香型白酒的研究與發展趨勢做了以下展望：

（1）目前對于復雜微生物之間的相互作用情況以及微生物彼此交叉代謝產生風味物質的途徑尚未有研究證明，只有進一步明確微生物菌群的代謝途徑、風味物質的形成機制才可以具有針對性的提高清香型白酒的品質與風味。

（2）中國白酒香型的發展是以清、濃、醬香型為主，經過多年演變逐漸發展到至十二種白酒香型。清香型白酒因其“清、正、甜、凈、長”、“清香純正、一清到底”的風格特征，使其具有很大的優勢，可以與多種香型相互結合，釀造出更多風味特征的白酒，以符合當今不同消費者對口感及風味的需求。

（3）目前，我國“十三五”規劃的大健康產業已成為國家戰略，以人民健康為核心，進行健康白酒的開發是今后研究的重點方向。通過生物、發酵工程技術手段發現、分離、篩選已知的、未知的天然健康因子產生的微生物融入清香型白酒發酵工藝中，充分利用代謝調控手段強化清香型白酒中健康成分。

（4）人體腸道微生態是指腸道內的微生物與人體之間相互作用，共同構成的一個生態系統，是微生物種類及數量最多的一個微生態，在眾多人體微生態中占據重要地位。清香型白酒中釀造過程中形成的微生態與人體腸道微生態均研究的是微生物發酵規律和微生態內的平衡關系，充分挖掘和利用清香型白酒釀造中的微生態，與人體腸道微生態建立一定的關聯，通過對有機原料發酵后產生的有益成分調控，經體外發酵和體內多次發酵形成更多的小分子量物質使人體更加容易吸收，這可以是今后研究的一個重要方向。