不同酵母對赤霞珠桃紅葡萄酒香氣的影響

郭靜嫻，謝 涵，華玉波，石 英，吳廣楓，段長青，蘭義賓*

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083；3.山東臺依湖葡萄酒業股份有限公司，山東 威海 264500）

21世紀以來，中國葡萄與葡萄酒產業發展迅速，葡萄栽培面積迅速擴大，葡萄總產量快速提升。我國的釀酒葡萄品種以紅葡萄品種為主，約占80%；白葡萄品種約占20%。赤霞珠（Vitis viniferacv.Cabernet Sauvignon）是第一主栽品種，其次是蛇龍珠（V.viniferacv.Gernischt）、美樂（V.viniferacv.Merlot）、霞多麗（V.viniferacv.Chardonnay）等[1]。目前，我國以優質干紅葡萄酒的生產為主，且常應用抽汁工藝來提升其感官品質，抽汁的部分主要用于新紅葡萄酒的釀造，生產出的桃紅葡萄酒具有濃郁的果香和花香，口感上有從干型到半甜型的不同風格，受到中國廣大消費者的歡迎。

香氣是評價葡萄酒的重要感官品質指標之一，香氣成分在葡萄酒中的種類、含量、性質及相互之間的平衡，決定了葡萄酒的風格和典型性[2]。研究表明，貢獻桃紅葡萄酒果香的香氣物質主要為高級醇類（如苯乙醇）、β-大馬士酮和一些酯類（如己酸乙酯和乙酸異戊酯）等，這些香氣物質多數與酵母發酵有關[3]。李景明等[4-5]分別分析了不同酵母發酵的赤霞珠干紅葡萄酒和貴人香（V.viniferacv.Italian Riesling）干白葡萄酒的香氣成分，研究結果均表明不同酵母發酵葡萄酒中的香氣物質種類差別微小，而醇類、酸類和酯類含量差別明顯，不同酵母產醇產酸產酯能力存在差異；李凱等[6]應用頂空固相微萃取（head space solid phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術結合香氣活力值（odoractivity value，OAV）對比了不同商業釀酒酵母釀造的玫瑰香（V.viniferacv.Muscat Hamburg）葡萄酒，發現不同商業釀酒酵母條件下玫瑰香葡萄酒的香氣輪廓存在差異，E491酵母發酵的玫瑰香葡萄酒香氣典型性強。

目前，有關不同酵母對桃紅葡萄酒香氣影響的研究較少，隨著桃紅葡萄酒占據越來越大的葡萄酒市場[7]，研究選擇合適的酵母菌來獲取具有典型風格的桃紅葡萄酒，是非常有必要的。本研究以赤霞珠葡萄為原料，利用頂空固相微萃取和氣質聯用技術分析比較了4種不同商業酵母（CY3079、Zymaflore X16、TXL和STR）發酵的赤霞珠桃紅葡萄酒在酒精發酵結束以及瓶儲陳釀一年后香氣物質之間的差異，研究不同酵母和瓶儲陳釀對新鮮桃紅葡萄酒中主要呈香物質的影響，以期為生產者在新鮮桃紅葡萄酒釀造過程中選擇合適的酵母提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：葡萄酒樣均采集于山東臺依湖葡萄酒業有限公司，利用4種不同類型的商業酵母釀造，分別為兩款產酯能力強的酵母，包括法國Laffort公司的Zymaflore X16酵母和法國Lamothe-abiet公司的STR酵母；一款在酒精發酵結束后能夠迅速自溶的酵母，為法國Lallemand公司的CY3079酵母，以及一款產硫醇能力強且產揮發性酚能力弱的酵母，為法國Lamothe-abiet公司的TXL酵母。葡萄酒灌裝后存放在恒溫、恒濕的酒窖中（溫度15 ℃，相對濕度75%）。取樣點為酒精發酵（alcoholic fermentation，AF）結束和瓶儲陳釀一年（1Y），共8個樣品，分別表示為CY3079-AF、X16-AF、TXL-AF、STR-AF、CY3079-1Y、X16-1Y、TXL-1Y和STR-1Y。取樣后的樣品存放于-20 ℃冰箱，用于后續分析。

氯化鈉（分析純）：北京化學試劑公司；C6-C24正構烷烴和所有揮發性物質標準品（純度＞99%）：美國Sigma公司，瑞士Fluka公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890 GC氣相色譜儀、Agilent 5975C MS質譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HP-INNOWAX毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25μm）：美國J&WScientific公司；CTCCombiPAL autosampler多功能自動進樣器：瑞士Zwingen公司；2 cm固相微萃取頭（DVB/CAR/PDMS）：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS條件

利用本實驗室已優化的頂空固相微萃取方法對葡萄酒香氣物質進行萃取[8-9]，具體步驟如下：取5 mL樣品、1 g NaCl和10 μL內標（4-甲基-2-戊醇，1.008 6 g/L）置于20 mL樣品瓶中，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。將樣品瓶置于多功能自動進樣器的托盤上，系統按照以下條件自動完成樣品萃取及進樣：將樣品置于40 ℃的加熱槽中保持30 min，然后將已活化的固相微萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取30 min，加熱槽轉速為500 r/min。然后將萃取頭插入氣相色譜進樣口，采用不分流模式，250 ℃熱解吸8 min。

利用本實驗室已經優化的氣質聯用的方法[8]，分析檢測樣品中的香氣物質。載氣為高純氦氣（He），流速為1 mL/min。柱溫箱的升溫程序為：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持5 min。質譜接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV。采用全離子掃描模式，質量掃描范圍為29～350 u。每個樣品重復進樣3次。

1.3.2 定性定量方法

香氣物質的定性分析[8]：采用自動質譜退卷積定性系統（auto mass spectral deconvolution &identification system，AMDIS）解譜，利用峰質譜圖、保留時間或保留指數，與標準品、美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011標準譜庫以及文獻收錄化合物的質譜信息進行匹配，進行化合物的定性分析。

香氣物質的定量分析[8]：在模擬酒溶液（酒精度12%vol，酒石酸7g/L，pH=3.3）中，配制15個濃度梯度的香氣物質標準溶液，制作標準曲線進行定量。

1.3.3 數據統計分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）和單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）采用XLSTAT軟件實現。8個葡萄酒樣品之間香氣物質含量的ANOVA分析采用Duncan 檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵的桃紅葡萄酒中香氣物質的差異

本研究共鑒定到40種香氣物質，包括9種高級醇類、8種直鏈脂肪酸乙酯類、7種高級醇乙酸酯類、8種其他酯類、4種萜烯及C13-降異戊二烯類、3種中短鏈脂肪酸類和1種醛類物質（見表1）。由表1可知，4種不同酵母發酵的桃紅葡萄酒在酒精發酵結束和經一年瓶儲陳釀后的香氣物質種類基本相似，但其含量有所差異。除正壬醇僅在瓶儲一年的樣品被檢出，乙酸癸酯僅在酒精發酵后的樣品中檢測出外，其他香氣物質均在8個酒樣中都被檢測到。通過OAV分析發現，共有17個香氣物質的濃度超過其感官閾值，其中己酸乙酯的OAV值達759，然后依次為乙酸異戊酯（OAV=561）、β-大馬士酮（OAV=413）、丁酸乙酯（OAV=118）、癸酸乙酯（OAV=104）、辛酸異戊酯（OAV=84）、辛酸（OAV=47）和乙酸乙酯（OAV=18），這些物質是赤霞珠桃紅葡萄酒的主要呈香物質。

表1 不同酵母發酵的赤霞珠桃紅葡萄酒在酒精發酵結束和瓶儲一年階段的香氣物質濃度Table 1 Concentrations of volatile compounds in Cabernet Sauvignon rose wines fermented by different yeast strains after alcoholic fermentation and one-year bottle aging

萜烯和C13-降異戊二烯類：C13-降異戊二烯和萜烯類物質主要來源于葡萄果實，是在葡萄漿果發育期間合成的次級代謝產物，具有較低的感官閾值，常貢獻葡萄酒優雅的花香和果香[2]。萜烯和C13-降異戊二烯類物質的總量在Zymaflore X16酵母發酵結束后的酒樣（X16-AF）達到最高，TXL酵母發酵的瓶儲一年酒樣（TXL-1Y）次之。其中超過閾值的僅有β-大馬士酮，該物質具有蜂蜜、煮蘋果味和花香等香氣，因其具有極低的感官閾值，僅為0.05 μg/L（水醇溶液）[10]，對葡萄酒香氣有重要的貢獻。8款葡萄酒中該物質的OAV值均超過179，在Zymaflore X16酵母發酵結束的酒樣和TXL酵母發酵的瓶儲一年的酒樣達到最高，分別為413和355。

高級醇乙酸酯類：高級醇乙酸酯是酒精發酵過程中酵母的醇乙酰轉移酶（alcohol acetyltransferases，ATF）催化乙酰輔酶A與糖或氨基酸降解代謝產生的高級醇反應形成的[16]。在酒精發酵后酒樣中高級醇乙酸酯類物質的總含量均遠高于瓶儲一年后的酒樣，Zymaflore X16酵母酒精發酵后酒樣（X16-AF）該類物質含量最高，其次為STR酵母酒精發酵后酒樣（STR-AF）。通過計算物質的OAV值發現，高級醇乙酸酯中乙酸異戊酯的OAV值達到最大（OAV＞100），乙酸異戊酯在酒精發酵后的酒樣中含量較高，瓶儲一年后其含量大幅度降低。Zymaflore X16酵母酒精發酵后酒樣（X16-AF）中乙酸異戊酯含量顯著高于其他三個酵母發酵的酒樣；瓶儲一年后，STR酵母發酵的酒樣中乙酸異戊酯含量則要高于其他三種酵母發酵的酒樣。

直鏈脂肪酸乙酯和其他酯類：脂肪酸乙酯類是酒精發酵過程中乙醇與酵母脂肪酸代謝過程中產生的脂酰輔酶A反應產生的，受酵母中乙酯合成酶（ethyl ester biosynthesis gene 1，EEB1）和乙醇乙酰轉移酶（ethanol hexanoyl transferase 1，EHT1）的調控，同時也與原料中脂肪酸的含量有關[17]。脂肪酸乙酯中對葡萄酒的香氣有直接貢獻的有丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸乙酯，而其他酯類中對香氣有直接貢獻的僅為辛酸異戊酯，其中己酸乙酯的OAV值最大（＞300），這些酯類均在CY3079和Zymaflore X16酵母發酵的酒精發酵后酒樣中含量較高，表明這些葡萄酒可能比其他葡萄酒樣品顯示出更濃郁的果香和花香。而瓶儲一年后，脂肪酸乙酯類物質在STR酵母發酵的酒樣中含量較高，但整體上這些化合物含量低于酒精發酵后酒樣，可能是由于酯類物質在瓶儲過程中水解而減少造成的[18]。

高級醇類：高級醇是酵母通過艾麗希途徑（Ehrlich pathway）降解氨基酸產生的，對葡萄酒香氣的貢獻主要取決于它們在葡萄酒中的濃度[19]。一般認為，當其質量濃度低于300 mg/L時可以產生愉悅的香氣，而葡萄酒中含有高于400 mg/L的高級醇時則表現為不良氣味[17]。本研究中，除了TXL酵母發酵的酒樣，其他酵母發酵的葡萄酒中的總高級醇含量均低于300 mg/L。不同酵母酒精發酵后高級醇含量的差異經瓶儲一年仍保持一致。物質濃度超過感官閾值的高級醇包括異丁醇、異戊醇和苯乙醇。在TXL酵母酒精發酵結束和瓶儲一年的酒樣中異丁醇含量均達到最高，但異戊醇則在Zymaflore X16酵母酒精發酵后的酒樣（X16-AF）中含量最高。苯乙醇具有玫瑰和蜂蜜的香氣，常被認為對葡萄酒的花香有較大貢獻，該物質在CY3079、X16和TXL三款酵母酒精發酵后的酒樣中含量均較高。

中短鏈脂肪酸類：不同酵母發酵的桃紅葡萄酒中共在檢測到3種脂肪酸，其中僅辛酸的濃度超過閾值。酒精發酵結束的酒樣中，CY3079-AF樣品中短鏈脂肪酸的含量最高，達27.07 mg/L，一定量的揮發性脂肪酸能夠提高葡萄酒香氣的復雜性[20]。經過1年的瓶儲陳釀，該類物質的含量大幅下降，其中在X16-1Y和STR-1Y酒樣中含量最低，僅為3～4 mg/L。

2.2 香氣物質輪廓圖對比

評價各香氣物質對酒香氣的貢獻用OAV值作為參考指標。研究中分別以酒精發酵后和瓶儲一年的樣品中OAV＞1的17種揮發性香氣化合物的香氣描述類別為維度，以OAV值總和的大小展示每種香味強弱做出香氣物質輪廓圖，結果見圖1。

圖1 不同酵母釀造的赤霞珠桃紅葡萄酒在酒精發酵結束（a）和瓶儲陳釀一年后（b）的香氣輪廓圖Fig.1 Aroma profile of a Cabernet Sauvignon rose wine fermented by different yeast strains after alcoholic fermentation (a) and one-year bottle storage and aging (b)

由圖1（a）可知，在酒精發酵結束階段，赤霞珠桃紅葡萄酒的果香、甜香和花香比較突出，而植物味較弱。通過比較4種酵母的香氣輪廓發現，利用酵母Zymaflore X16發酵的桃紅葡萄酒中果香、甜香最高，依次為CY3079、TXL和STR，這與乙酸異戊酯、辛酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的含量較高有關；而CY3079酵母發酵的葡萄酒中脂肪味較突出，這與CY3079產生較多的中短鏈揮發性脂肪酸有關（如辛酸等），這與CY3079酵母容易自溶有關。此外，CY3079-A和TXL-AF酒樣中的植物味顯著高于X16-AF和STR-AF。

由圖1（b）可知，瓶儲陳釀一年后桃紅葡萄酒中最濃郁的香氣類型依然是果香，其次是甜香和花香，這與酒精發酵結束酒樣的結果一致。但是，經過一年的瓶內陳釀，果香濃郁度顯著低于酒精發酵結束階段，這是因陳釀階段脂肪酸乙酯、高級醇乙酸酯等酯類物質的下降引起的。通過比較4種酵母發酵酒樣的香氣輪廓發現，瓶內陳釀一年后不同處理葡萄酒之間的果香、甜香和花香濃郁度差異變小，而脂肪味和植物味的差異變大。TXL-1Y酒樣中脂肪味最為濃郁，其次為酒樣CY3079-1Y、STR-1Y和X16-1Y。

2.3 主成分分析

為了進一步分析不同的酵母發酵的桃紅葡萄酒在酒精發酵結束和瓶儲一年階段香氣物質的差異，選擇OAV值＞0.1的19個揮發性香氣物質作為自變量進行主成分分析，結果見圖2。

由圖2（a）的PCA得分圖可以看出，主成分1（PC1）可以解釋52.62%的初始變量，能夠將4種酵母酒精發酵結束和瓶儲一年的樣品分開，酒精發酵后的樣品位于PC1正半軸，瓶儲一年后的樣品位于PC1負半軸。由圖2（b）載荷圖可以看出，與PC1呈正相關的物質為直鏈脂肪酸乙酯（如丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等）、高級醇乙酸酯（如乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯等）和中短鏈脂肪酸（如丁酸、辛酸和癸酸等），說明了上述這些在酒精發酵階段酵母代謝產生的香氣物質在瓶內陳釀過程中快速下降，導致了桃紅葡萄酒的果香、甜香和脂肪味的濃郁度呈下降趨勢。主成分2（PC2）可以解釋17.61%的初始變量，能夠將CY3079發酵的酒樣與其他酵母分開，位于PC2的負半軸。由圖2（b）可知，與PC2呈正相關的物質主要包括異戊醇、乙酸乙酯、異丁醇、苯乙醇和β-大馬士酮，而與PC2呈負相關的物質主要有3-甲硫基丙醇和正己醇。說明與其他酵母相比，CY3079酵母發酵酒樣的特征物質是高含量的3-甲硫基丙醇和正己醇。另外，STR和TXL兩款酵母酒精發酵結束階段香氣物質輪廓極其相似，而Zymaflore X16、STR和TXL三款酵母發酵葡萄酒陳釀一年后香氣物質輪廓較為類似。綜合PC1和PC2來看，Zymaflore X16和CY3079酵母在酒精發酵階段的產酯能力強于STR和TXL酵母，但是這種差異隨著瓶內陳釀逐漸縮小。

圖2 不同酵母發酵的赤霞珠桃紅葡萄酒香氣物質的主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.2 Score plot (a) and loading plot (b) of principal component analysis of aroma compounds in Cabernet Sauvignon rose wines fermented by different yeast strains

3 結論

采用頂空固相微萃取和氣相色譜與質譜聯用技術分析比較了不同酵母發酵的赤霞珠桃紅葡萄酒的香氣物質差異。結果表明，CY3079、Zymaflore X16、TXL和STR四種酵母發酵的赤霞珠桃紅葡萄酒中主要香氣的組成種類基本相似，但不同香氣物質含量存在差異。總體上，赤霞珠桃紅葡萄酒的主要呈香物質為己酸乙酯、乙酸異戊酯、β-大馬士酮、丁酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸異戊酯、辛酸和乙酸乙酯等香氣物質。酒精發酵結束階段，Zymaflore X16和CY3079酵母產生脂肪酸乙酯等酯類物質的能力較強，賦予其更加濃郁的果香、甜香和花香；經過一年瓶儲后，4款酵母發酵的桃紅葡萄酒中酯類物質快速水解，減小了酯類物質含量的差異，最終縮小了葡萄酒果香、甜香和花香的差異。本研究的結果表明，商業酵母的選擇對桃紅葡萄酒的香氣品質的影響十分重要，合理應用不同類型的酵母是釀造不同香氣風格類型的桃紅葡萄酒的重要手段。