農(nóng)桿菌介導小球藻快速轉(zhuǎn)化方法的建立與條件優(yōu)化

郭娟娟，李江洪，龍婷婷，莫 易，于靜澤，張 鵬，李勇昊*

（1.泉州師范學院 海洋與食品學院，福建 泉州 362000；2.重慶科技學院工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點實驗室，重慶 401331；3.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室，福建 泉州 362000）

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是光合效率很高的單細胞真核綠藻，培養(yǎng)條件簡單，生產(chǎn)成本低，易于大規(guī)模培養(yǎng)；同時富含氨基酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸和色素等生物活性物質(zhì)[1]，是衛(wèi)生部批準的新資源食品；此外被廣泛用于活性物質(zhì)提取、污水處理、生物柴油等領(lǐng)域[2-5]。因此建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，為實現(xiàn)代謝工程育種、利用合成生物學生產(chǎn)高附加值天然產(chǎn)物及為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用提供有效技術(shù)支持[6-7]。

根瘤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法由于具有更高的轉(zhuǎn)化效率和良好的轉(zhuǎn)基因微生物遺傳穩(wěn)定性被廣泛用于微藻的遺傳轉(zhuǎn)化[8]。侯善茹等[9]建立了農(nóng)桿菌介導雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）的轉(zhuǎn)化方法，但是試驗將共培養(yǎng)48 h后的微藻轉(zhuǎn)接篩選培養(yǎng)基，7 d后得到轉(zhuǎn)化子，總體轉(zhuǎn)化時間超過10 d。馮興標等[10]建立農(nóng)桿菌介導C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化體系，培養(yǎng)11 d后得到陽性轉(zhuǎn)化子。CHENG Y等[11]利用根瘤農(nóng)桿菌介導的方法實現(xiàn)Schizochytriumsp.的遺傳轉(zhuǎn)化，在篩選平板上光照培養(yǎng)7 d后成功獲得轉(zhuǎn)化子。THYE S C等[12]采用根瘤農(nóng)桿菌介導方法建立了小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化，但是共培養(yǎng)時間耗時3 d，共培養(yǎng)結(jié)束轉(zhuǎn)到篩選平板需要7 d才能得到陽性轉(zhuǎn)化子。以上數(shù)據(jù)表明，微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系基本成熟，但是利用生長較慢的自養(yǎng)微藻細胞為受體會顯著延長轉(zhuǎn)化時間，同時具有易污染以及假陽性多等風險。

因此，利用可異養(yǎng)的C.pyrenoidosa為研究對象，探索根瘤農(nóng)桿菌介導其遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，并對主要參數(shù)包括農(nóng)桿菌濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基pH以及共培養(yǎng)溫度進行優(yōu)化。建立短時高效的農(nóng)桿菌介導異養(yǎng)微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，并且為其他可異養(yǎng)微藻的高效遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）：中國科學院武漢水生生物所；根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1、GV3101和LBA4404感受態(tài)：上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pCXSN：本實驗室保存。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：碧云天生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和DNA序列測定由北京擎科生物科技有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（用于根瘤農(nóng)桿菌活化與培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

BG11培養(yǎng)基（小球藻自養(yǎng)）：硝酸鈉1.5 g/L、三水磷酸氫二鉀0.04 g/L、碳酸鈉0.02 g/L、七水硫酸鎂75 mg/L、二水氯化鈣36 mg/L、檸檬酸6 mg/L、檸檬酸鐵銨6 mg/L、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）1 mg/L、硝酸2.86 mg/L、一水氯化錳1.81 mg/L、七水硫酸鋅0.222 mg/L、五水硫酸銅0.079 mg/L、二水鉬酸鈉0.39 mg/L、六水硝酸鈷0.049 mg/L；異養(yǎng)培養(yǎng)時加入葡萄糖20 g/L和酵母粉2 g/L。

誘導培養(yǎng)基（induction medium，IM）：K2HP410 mmol/L、KH2PO410 mmol/L、NaCl 2.5 mmol/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.7 mmol/L、FeSO49 μmol/L、（NH4）2SO44 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、甘油0.5%、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）200 μmol/L。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（co-culture medium，CM）：即IM培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L。

篩選培養(yǎng)基：在異養(yǎng)培養(yǎng)基基礎上添加潮霉素B40μg/mL和頭孢霉素500 μg/mL。

1.2 儀器與設備

iMark酶標儀：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；ZWYR-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制備有限公司；5804R冷凍離心機：德國艾本德股份公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱、MGC-250BP-2L LED光源光照培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；A600梯度PCR儀：杭州朗基科學儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

按說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌細胞，將含有質(zhì)粒pCXSN的A.tumefaciensAGL-1、GV3101和LBA4404分別劃線接種于含有相應抗生素的平板上于28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單克隆菌株用于后續(xù)研究。C.pyrenoidosa劃線于異養(yǎng)培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)2 d。將單克隆藻株活化后按接種量5%分別接種到50 mL自養(yǎng)與異養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其中自養(yǎng)微藻置于28 ℃光照培養(yǎng)，異養(yǎng)微藻于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。定時取樣測定OD517nm值，繪制生長曲線[13]。

1.3.2 抗生素的敏感性檢測

100 μLC.pyrenoidosa分別涂布于含有不同濃度潮霉素B和頭孢霉素的異養(yǎng)培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)2 d。潮霉素B質(zhì)量濃度分別為0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL；頭孢霉素質(zhì)量濃度分別為0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400 μg/mL和500 μg/mL。

1.3.3 根瘤農(nóng)桿菌介導C.pyrenoidosa遺傳轉(zhuǎn)化

C.pyrenoidosa于28 ℃，異養(yǎng)培養(yǎng)至對數(shù)末期，180 r/min離心去上清，無菌水稀釋至107個細胞/mL備用；活化的三種A.tumefaciens接種到IM培養(yǎng)基培養(yǎng)至一定濃度，取100 μL菌液與100 μLC.pyrenoidosa混勻，涂布于事先覆蓋滅菌玻璃紙的CM培養(yǎng)基，一定溫度條件下暗培養(yǎng)相應時間，將玻璃紙轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)2 d挑取潛在的陽性轉(zhuǎn)化子進行驗證，轉(zhuǎn)化效率計算公式如下：

1.3.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化單因素試驗

分別在IM培養(yǎng)基培養(yǎng)含有pCXSN質(zhì)粒的A.tumefaciensAGL-1、GV3101和LBA4404，使其OD600nm值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，進行轉(zhuǎn)化試驗，根據(jù)轉(zhuǎn)化子個數(shù)/106微藻確定農(nóng)桿菌種類與濃度對轉(zhuǎn)化率的影響。設置乙酰丁香酮濃度分別為0、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L和500 μmol/L；共培養(yǎng)溫度分別為20 ℃、22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃和28 ℃；共培養(yǎng)時間分別為12 h、24 h、40 h、48 h、72 h和96 h；CM培養(yǎng)基pH分別為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8和6.0。同上方法確定不同條件對轉(zhuǎn)化率的影響，均做3個平行試驗。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子的驗證及分析

篩選培養(yǎng)基隨機挑取單菌落，采用異養(yǎng)培養(yǎng)基28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d后以菌液為模板，sF-pCXSN（TCATCGCAAGACCG-GCAACA）與sR-pCXSN（ACCTCGACCTCAACACAACA）為引物進行PCR驗證。反應體系（12.5 μL）：模板0.5 μL、兩個引物各0.5 μL、PlantTaqTMDNA聚合酶（2×）6.25 μL、雙蒸水（ddH2O）4.75 μL。反應條件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45s，30次循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻生長曲線

自養(yǎng)與異養(yǎng)條件下蛋白核小球藻的生長曲線見圖1。由圖1可知，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，可迅速進入對數(shù)期，并在培養(yǎng)62 h后達到穩(wěn)定期且OD517nm值=8.127，然后逐漸下降；而自養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長速度顯著降低，由于接種量低導致在80 h依然處于遲緩期。說明分別以20 g/L葡萄糖和2 g/L酵母粉為碳氮源可在無光條件下實現(xiàn)C.pyrenoidosa的快速培養(yǎng)，且生長速度為自養(yǎng)培養(yǎng)的3～5倍。

圖1 不同培養(yǎng)方式對蛋白核小球藻生長的影響Fig.1 Effect of different cultivation methods on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.2 抗生素的敏感性檢測

由于篩選培養(yǎng)基添加潮霉素B篩選陽性轉(zhuǎn)化子，頭孢霉素抑制根瘤農(nóng)桿菌生長；因此檢測兩種抗生素對C.pyrenoidosa的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的潮霉素B對蛋白核小球藻生長的影響Fig.2 Effects of different hygromycin B concentrations on the growth of Chlorella pyrenoidosa

由圖2可知，當潮霉素B質(zhì)量濃度在10 μg/mL時對藻體的生長無顯著影響，藻落生長仍然比較旺盛，與對照組生長情況無顯著差異；當其質(zhì)量濃度達到20 μg/mL即對藻體生長有極顯著的抑制作用（P＜0.01），但是其質(zhì)量濃度在20 μg/mL時培養(yǎng)基上仍然會有少量藻落生長。當其質(zhì)量濃度達到30 μg/mL及以上時會完全抑制藻體的生長。因此，為篩選陽性轉(zhuǎn)化子且避免假陽性出現(xiàn)，試驗確定以40 μg/mL潮霉素B作為篩選培養(yǎng)基的抗生素濃度。

頭孢霉素會抑制根瘤農(nóng)桿菌的生長，但對C.pyrenoidosa的影響尚不清楚。不同濃度的頭孢霉素對C.pyrenoidosa生長的影響結(jié)果見圖3。C.pyrenoidosa在加有不同濃度頭孢霉素的培養(yǎng)基上的生長情況與不添加頭孢霉素的微藻生長情況無顯著性差異，可確定頭孢霉素對C.pyrenoidosa生長無抑制作用。因此，篩選培養(yǎng)基中可添加500 μg/mL頭孢霉素抑制根瘤農(nóng)桿菌的生長，利于陽性C.pyrenoidosa的生長與挑選。

圖3 不同質(zhì)量濃度的頭孢霉素對蛋白核小球藻生長的影響Fig.3 Effect of different cephalosporin concentrations on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.3 農(nóng)桿菌種類及濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌種類及濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響見圖4。由圖4可知，A.tumefaciensGV3101和LBA4404在菌株濃度OD600nm值=0.2～1.0條件下，均可成功侵染C.pyrenoidosa獲得陽性轉(zhuǎn)化子。當OD600nm值=0.6時，GV3101介導轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化率為53.84個轉(zhuǎn)化子/106個微藻，LBA4404介導轉(zhuǎn)化效率為轉(zhuǎn)化子47.57個/106個微藻，而使用AGL-1獲得轉(zhuǎn)化效率僅為4.23個轉(zhuǎn)化子/106個微藻，GV3101和LBA4404介導轉(zhuǎn)化效率分別是AGL-1的12.73倍和11.24倍；已有文獻報道不同根瘤農(nóng)桿菌介導不同物種遺傳轉(zhuǎn)化具有不同的效率，且差異很大[14-15]，本試驗說明根瘤農(nóng)桿菌AGL-1不宜用于介導C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化。

進一步檢測GV3101和LBA4404在不同菌濃下對介導C.pyrenoidosa轉(zhuǎn)化效率的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率隨著LBA4404菌株濃度的提高而增加，當OD600nm值=1.0時，轉(zhuǎn)化效率為60.12個轉(zhuǎn)化子/106個微藻；而GV3101濃度OD600nm值=0.8時獲得最高的轉(zhuǎn)化效率，為64.01個轉(zhuǎn)化子/106個微藻。說明兩種農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404均可實現(xiàn)C.pyrenoidosa的異養(yǎng)轉(zhuǎn)化，且并無顯著性差異（P＞0.05），但是由于GV3101可以在更短的時間內(nèi)生長到OD600nm值=0.8，因此選用菌株為農(nóng)桿菌GV310且OD600nm值=0.8進行后續(xù)試驗。

圖4 農(nóng)桿菌種類與濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of Agrobacterium species and concentration on transformation efficiency

2.4 優(yōu)化根瘤農(nóng)桿菌GV310介導的轉(zhuǎn)化方法

對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，結(jié)果見圖5。由圖5可知，AS濃度在200 μmol/L以下時轉(zhuǎn)化效率隨濃度的增加而提高，且AS濃度=400 μmol/L時也可獲得高轉(zhuǎn)化效率。但是考慮試驗成本，選用AS濃度為200 μmol/L進行后續(xù)試驗，然而本試驗研究發(fā)現(xiàn)當AS濃度為300 μmol/L時會降低小球藻轉(zhuǎn)化效率，原因可能是抑制了根瘤農(nóng)桿菌的活性以及小球藻的萌發(fā)。隨著A.tumefaciensGV3101與C.pyrenoidosa共培養(yǎng)溫度升高根瘤農(nóng)桿菌活性增強，有利于其侵染小球藻實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，而溫度過高后更利于根瘤農(nóng)桿菌的生長從而降低其侵染小球藻活性導致轉(zhuǎn)化效率下降，本研究表明當共培養(yǎng)溫度為24 ℃時轉(zhuǎn)化效率最高達到85.33個轉(zhuǎn)化子/106個微藻。本試驗初期并未設置24 ℃共培養(yǎng)溫度，但試驗過程中發(fā)現(xiàn)在25 ℃共培養(yǎng)條件下可看到農(nóng)桿菌生長，所以降低溫度抑制其生長，進而提高了轉(zhuǎn)化效率。在共培養(yǎng)時間＜40 h之前，隨著共培養(yǎng)時間增長可以提高轉(zhuǎn)化效率，但超過40 h后繼續(xù)提高共培養(yǎng)時間會降低得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，因此最佳共培養(yǎng)時間是40 h，因為只有保證足夠的共培養(yǎng)時間才能夠給予根瘤農(nóng)桿菌足夠的時間實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，但是過長的培養(yǎng)時間會促進GV3101生長反而不利于轉(zhuǎn)化同時易使轉(zhuǎn)化子不易分辨，有報道小球藻轉(zhuǎn)化過程中共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高[12]，但是該研究使用的是自養(yǎng)小球藻，培養(yǎng)基不適宜農(nóng)桿菌生長，因此若利用異養(yǎng)微藻進行遺傳轉(zhuǎn)化，需要降低共培養(yǎng)時間，完成轉(zhuǎn)化且保證農(nóng)桿菌不宜生長。當pH值為5.4時，得到最高的轉(zhuǎn)化效率為82.58個轉(zhuǎn)化子/106微藻。但當pH值過高或過低時，轉(zhuǎn)化效率均會受到影響。通過優(yōu)化試驗使轉(zhuǎn)化效率較優(yōu)化前提高了29%。

圖5 不同參數(shù)對根瘤農(nóng)桿菌介導的蛋白核小球藻遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effect of different parameters on Agrobacterium-mediated transformation efficiency of Chlorella pyrenoidosa

2.5 轉(zhuǎn)化子的驗證及分析

前期研究表明A.tumefaciensGV3101可成功實現(xiàn)異養(yǎng)培養(yǎng)C.pyrenoidosa的遺傳轉(zhuǎn)化，且在篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后即可出現(xiàn)單藻落，結(jié)果見圖6A。由圖6A可知，清晰可見深綠色的C.pyrenoidosa單藻落為潛在的陽性轉(zhuǎn)化子。隨機挑取10個單菌落培養(yǎng)后進行菌液PCR驗證，結(jié)果見圖6B。由圖6B可知，在1 000 bp左右的有明顯特異性條帶，這與目的片段的理論大小942 bp相符合，說明外源DNA片段成功整合到C.pyrenoidosa基因組中。

圖6 蛋白核小球藻轉(zhuǎn)化子篩選平板（A）以及PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子（B）Fig.6 Screening plate of pyrenoid Chlorella pyrenoidosa transformation(A) and confirmation of positive transformants via PCR (B)

對比目前已報道的不同方法實現(xiàn)單細胞綠藻遺傳轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果見表1。由表1可知，與其他使用自養(yǎng)微藻進行遺傳轉(zhuǎn)化相比，本研究使用異養(yǎng)小球藻比現(xiàn)有報道普遍縮短了3～5倍得到陽性轉(zhuǎn)化子的時間。且由表1可知，農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化具有最高的轉(zhuǎn)化效率，與本研究結(jié)果一致。因此本研究高效且快速的蛋白核小球藻遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立不僅為后續(xù)小球藻遺傳改造提供了技術(shù)手段，而且也為其他可異養(yǎng)微藻實現(xiàn)快速轉(zhuǎn)化提供科學依據(jù)。

表1 不同方法實現(xiàn)單細胞綠藻的遺傳轉(zhuǎn)化效率Table 1 Genetic transformation efficiency of the unicellular green alga with different approaches

3 結(jié)論

本研究嘗試建立異養(yǎng)微藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，最終發(fā)現(xiàn)調(diào)整根瘤農(nóng)桿菌GV3101初始OD600nm值=0.8，小球藻濃度為107個/mL時，各取100 μL混合涂布在pH=5.4、乙酰丁香酮濃度為200 μmol/L的CM平板上，24 ℃避光培養(yǎng)40 h后轉(zhuǎn)到含有潮霉素B的篩選培養(yǎng)基，僅2 d轉(zhuǎn)化子便清晰可見，數(shù)目達88個轉(zhuǎn)化子/106微藻，轉(zhuǎn)化子通過傳代后菌液PCR鑒定均為陽性轉(zhuǎn)化子，陽性率達100%。利用異養(yǎng)微藻進行遺傳轉(zhuǎn)化不但可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，同時轉(zhuǎn)化時間比使用自養(yǎng)微藻為受體細胞普遍減少3～5倍，為后續(xù)小球藻代謝工程改造或者以小球藻為底盤微生物的合成生物學研究與應用提供技術(shù)手段，并且為其它可異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的高效遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。