不同產區赤霞珠干紅葡萄酒非揮發風味物質的差異性分析

王 燕，李德美 *，孫智文，王宗義

（1.北京農學院 食品科學與工程學院，北京 102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）是一種用于釀造葡萄酒的紅葡萄品種，原產自法國波爾多（Bordeaux）地區，生長容易，適合多種不同氣候，在全世界都有廣泛種植，雖然幾乎有葡萄酒出產的地方都可以見到赤霞珠的身影，但是它在世界各地區的表現是有所差異的。赤霞珠葡萄在中國葡萄酒產區栽培范圍最廣[1]，主要產區包括山東半島、寧夏賀蘭山東麓、新疆、河北、云南、山西清徐、甘肅武威等[2]。葡萄酒的感官品質主要包括色澤、香氣及口感，其中口感是葡萄酒感官品質的重要方面，葡萄酒的基本味覺成分都是可溶于水或酒精水溶液中的非揮發物質[3]，主要包括糖類、醇類、有機酸類和酚類物質，而酚類物質對紅葡萄酒感官的作用尤為重要[4]。發酵過程中酵母利用糖分發酵成酒精，同時產生大量的中間與最終產物（如甘油等），這些成分構成了葡萄酒的甜味來源。葡萄酒中的酸類物質主要包括來自果實的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸以及蘋果酸-乳酸發酵產生的乳酸。多酚在葡萄酒中產生澀感和/或苦味，葡萄酒中的多酚化合物主要來自葡萄果皮、籽和果梗[5]，橡木也會給葡萄酒增加一些單寧[6]。單寧具有澀感，分為水解單寧和縮合單寧[7]。縮合單寧屬于黃烷-3-醇類[8]，在葡萄酒中主要是由兒茶素類化合物通過C4～C6和C4～C8鍵形成的聚合物[9]。原花青素是原花色素（縮合單寧）中最主要的一類化合物，是葡萄酒中的主要多酚，原花青素二聚體B1和B2是葡萄中最豐富的。紅葡萄酒的苦味主要是由閾值濃度下黃烷-3-醇產生的，黃烷-3-醇類單體包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表棓兒茶素、棓兒茶素等，其中兒茶素雖然也呈澀感通常被認為貢獻更多的苦味[4]。葡萄酒中非揮發風味物質種類繁多，并且不同風味物質之間存在相互作用（中和效應、協同效應、拮抗效應）[10]，因此，紅葡萄酒的味感平衡表現為甜味與酸味、苦澀感的總和的平衡，即甜味?酸味＋苦味[11]。

酚類物質對紅葡萄酒的收斂性具有重要作用[12]，研究表明，葡萄酒的干澀與兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素及原花青素B1、B2含量顯著正相關[13]。左俊偉[14]對不同產區赤霞珠干紅葡萄酒口感特征分析發現，酸味、澀味、苦澀味、豐厚度為各產區酒樣的主要特征口感物質。非揮發風味物質對葡萄酒風味特征的影響首先取決于品種[15]。其次，同一品種在不同的生態因素（溫度、光照、土壤和水）的互相作用下，其果實特性和葡萄酒品質參數都會受到影響[16]。即使在同一產區，不同地塊葡萄園所產的葡萄酒其揮發性成分在種類和含量都表現為各自特有的品質特性[17]。國內外研究已經證實同一釀酒葡萄品種在不同產區栽培，其果實品質具有地域特征性。楊洋等[18]研究了三個不同產區赤霞珠葡萄果實品質的指標發現，新疆石河子、山東蓬萊和寧夏銀川果實的含糖量、可滴定酸含量、總酚和單寧含量以及揮發性香氣物質的組成等果實品質指標均存在顯著差異。馬磊[19]通過超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析葡萄酒中非揮發風味物質，實現對葡萄酒樣品在產區和品種間的有效識別，證明了中國葡萄酒基于有機酸和酚類物質的種類和含量具有良好產地和品種間的特征性。國外研究學者基于葡萄酒的風味成分對葡萄酒產區和品種特征性的研究已經很廣泛，BOSELLI E 等[20]對意大利白葡萄酒指紋圖譜分析，表明了同一產區、不同品種其化學成分和感官特性完全不同。SOUFLEROS E H等[21]通過對白葡萄酒中游離氨基酸的含量實現了產地、品種和年份的判別分析。

本研究以中國寧夏賀蘭山東麓、河北懷來、新疆焉耆等三個產區出產的2016年份15款赤霞珠干紅葡萄酒為對象，選定的三個葡萄酒產區南北緯度上差異不大，但海陸熱力性差異突出，自東向西從濕熱的海洋氣候過渡到干旱半干旱的沙漠氣候[22]，采用光譜法、比色法和高效液相色譜法分析非揮發風味物質（糖類、醇類、酸類及酚類等）含量，尋找葡萄酒中非揮發風味物質與產區之間的聯系與差異，討論通過非揮發風味物質區分不同產區葡萄酒的可能性，以期對不同風土條件下葡萄酒的風格特征研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒樣

樣品取自中國三個葡萄酒產區（寧夏賀蘭山東麓、新疆焉耆、河北懷來）不同酒莊出產的2016年15款赤霞珠干紅葡萄酒，均采用傳統工藝釀造，酒樣信息詳見表1。

表1 酒樣信息Table 1 Information of wine samples

1.1.2 化學試劑

福林-酚（Folin-Ciocalteau）試劑盒、沒食子酸標準品（純度≥98%）、對二甲基氨基肉桂醛（4-dimethylamino-cinnamon-aldehyde，DMACA）試劑盒、兒茶素標準品（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L）：西班牙Bio Systems S.A.公司；原花青素標準品（純度≥95%）：北京博奧拓達科技有限公司；兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，EcG）、表棓兒茶素（epigallocatechin，EgC）、棓兒茶素（gallocatechin，GC）、原花青素B1（procyanidin B1，PC B1）、原花青素B2（procyanidin B2，PC B2）（純度均≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇、乙酸乙酯（均為分析純）：北京化工廠；甲醇、乙酸、乙腈（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FOSS WineScanTM葡萄酒分析儀：丹麥福斯（中國）有限公司；Bio Systems S.A.Y350半自動分析儀：西班牙Bio Systems S.A.公司；UV-1780分光光度計、LC-20AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有SPDM20A紫外檢測器和LabSolutions色譜數據處理系統）：島津（中國）有限公司；platisil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）：北京迪馬科技有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III循環水真空泵：上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣常規理化指標測定

酒精度、還原糖、總酸、pH、揮發酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等采用FOSS WineScanTM葡萄酒分析儀檢測。

1.3.2 總酚和黃烷醇含量的測定

（1）總酚含量的測定[23-24]

用移液槍精確吸取沒食子酸標準品/酒樣12 μL于比色皿中，加入Folin-Ciocalteau試劑盒A液800 μL，室溫（16～25 ℃）反應2 min，然后加入B液800 μL混勻，室溫反應8 min，分別在波長750 nm條件下測定試劑空白、標準品和酒樣的吸光度值A。以沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，得到回歸方程：y=0.000 7x+0.01，相關系數（R2）＞0.99。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總酚含量（以沒食子酸計）。

（2）黃烷醇含量的測定[25]

精確吸取標準品/酒樣24 μL于比色皿中，加入DMACA試劑盒中A液800 μL，混勻，室溫反應2 min，在波長620 nm條件下測吸光度值A1。然后在反應體系中加入B液800 μL（B1液和B2液現用現混），混勻，室溫反應5 min。在乙醇和酸性介質的存在下，樣品中的黃烷醇類物質與發色基團對二甲基氨基肉桂醛反應，形成有色復合物，在波長620 nm條件下測定試劑空白、標準品和酒樣的吸光度值A2。根據如下公式計算標準品/樣品吸光度值的增量：

A=（A2-0.49×A1）標品/樣品-（A2-0.49×A1）試劑空白

以兒茶素質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制兒茶素標準曲線，回歸方程：y=0.000 9x+0.010 4，相關系數（R2）=0.999 4。按照標準曲線回歸方程計算樣品中黃烷醇含量（以兒茶素計）。

1.3.3 總原花青素含量的測定[26]

溶液配制：2%硫酸鐵銨溶液、鹽酸正丁醇溶液、2 mol/L鹽酸溶液、0.5 mg/mL原花青素標準品溶液。

原花青素標準曲線的制作：用刻度移液管分別精確吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL原花青素標準品溶液于25 mL比色管中，用體積分數為95%乙醇定容至3 mL，得到原花青素標準品質量濃度梯度為0、0.017 mg/mL、0.033 mg/mL、0.050 mg/mL、0.067 mg/mL、0.083 mg/mL。然后分別加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液和6 mL鹽酸正丁醇溶液，蓋塞，搖勻。在95 ℃恒溫水浴中保持40 min，取出，浸入冷水中快速冷卻，溶液顯紅色（或黃色）。取出比色管，在波長546 nm條件下測定其吸光度值，以原花青素質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制原花青素標準曲線，得到回歸方程：y=43.684x+0.664 7，相關系數（R2）=0.999 7。

樣品稀釋及測定：吸取樣品1～2 mL于25 mL容量瓶中，定容至刻度，取3 mL稀釋后樣品，按標準品溶液的測定步驟，測定酒樣的吸光度值，按照原花青素標準曲線回歸方程計算酒樣中總原花青素的含量。

1.3.4 黃烷-3-醇單體和原花青素B1、B2含量的測定[27]

酒樣前處理：采用乙酸乙酯液-液萃取法，取10 mL酒樣，用30 mL乙酸乙酯，萃取3次，收集有機相，旋轉蒸發儀（25 ℃）濃縮至干，用10 mL色譜級甲醇溶解，-18 ℃避光保存，待液相色譜分析。樣品測定前經0.22 μm微孔濾膜過濾。

液相色譜分析條件：采用platisil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），紫外檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min。流動相A為水∶乙酸（98∶2，V/V），流動相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～10 min，10%B；10～15 min，10%～20%B；15～26 min，20%～40%B；26～30 min，40%～100%B；30～35 min，100%～10%B；35～40 min，10%B。

酚類物質單體標準曲線的繪制：精確稱取7種酚類物質標準品5 mg，于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到500 mg/L的混合標準品溶液，稀釋成不同濃度梯度，-18 ℃保存。

1.3.5 數據處理

通過IBM SPSS Statistics 22.0對酒樣理化指標進行單因素方差分析（anaylsis of variance，ANOVA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。實驗數據均平行測定3次，結果以平均值±標準差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 黃烷-3-醇單體和原花青素B1、B2的含量的測定

對7種物質混標進樣分析，標準品高效液相色譜圖見圖1。由圖1可知，7種物質能得到有效分離且出峰時間穩定。按照優化好的色譜條件進樣分析，以峰面積（y）為縱坐標，物質含量（x）為橫坐標，建立標準曲線，回歸方程、相關系數見表2。由表2可知，各物質的含量與峰面積呈良好的線性關系，相關系數（R2）＞0.99，各物質的最低檢測限均低于0.20 mg/L，將同一標樣和樣品分別連續進樣6次，記錄其保留時間和峰面積，標準品和樣品保留時間的相對標準偏差均在1%以內，峰面積的相對標準偏差均在4%以內，表明色譜工作穩定、重復性好。

圖1 7種酚類物質標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 7 phenols standards

表2 各酚類物質的標準曲線和保留時間Table 2 Standard curve and retention time of each phenols

根據上述色譜條件，對采集的酒樣進行測定，按照各酚類物質的標準曲線回歸方程計算酒樣中各酚類物質含量。

2.2 不同產區干紅葡萄酒非揮發風味物質特征的比較

不同產區酒樣理化指標測定結果見表3。

表3 不同產區赤霞珠干紅葡萄酒樣品理化指標Table 3 Physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon dry red wine samples from different regions

由表3可知，不同產區赤霞珠干紅葡萄酒酒石酸、總酚、總原花青素、黃烷醇、原花青素B1、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素沒食子酸酯含量存在顯著差異；新疆焉耆產區與寧夏賀蘭山東麓產區相比，酒石酸、總原花青素、黃烷醇、原花青素B1、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B2含量存在極顯著差異（P＜0.01），總酚和表兒茶素沒食子酸含量存在顯著差異（P＜0.05）；河北懷來產區與寧夏賀蘭山東麓產區相比，總酚、總原花青素、表棓兒茶素含量存在極顯著差異（P＜0.01），原花青素B2含量存在顯著差異（P＜0.05）。存在差異性的原因可能是因為三個產區的氣候、光照、降水量、土壤以及葡萄酒釀造和陳釀方式的不同。

2.3 赤霞珠干紅葡萄酒的非揮發風味物質含量主成分分析和層次聚類分析

對供試酒樣非揮發風味物質含量進行主成分分析，大量原始信息被降為前2個主成分，分別占總體方差貢獻率的33.66%和27.07%，占總成分的60%以上。各指標在前2個主成分上的載荷圖見圖2。由圖2可知，總酚、黃烷醇、總原花青素、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素沒食子酸酯聚集在第1主成分的正向端，酒精度、還原糖、總酸、檸檬酸、蘋果酸聚集在第2主成分的正向端。第1主成分中包含的物質都是與葡萄酒的苦澀感相關的酚類物質，第2主成分中包含的物質是與葡萄酒甜感和酸感相關的物質，結果表明干紅葡萄酒中的酚類物質是影響其風格和品質的重要因素。

圖2 理化指標主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factors load diagram of physical and chemical indexes by principal component analysis

不同產區干紅葡萄酒層次聚類分析結果見圖3。由圖3可知，新疆焉耆產區酒樣與其他產區酒樣可以明顯歸為兩類，結合表3，焉耆產區酒樣還原糖和總酸含量均高于另外兩個產區，可能因為焉耆產區氣候相對溫暖、日照強烈、干燥少雨，使釀酒葡萄酒積累濃郁的風味物質。寧夏賀蘭山東麓產區與河北懷來產區酒樣也得到了很好的區分，結合表3，河北懷來產區酒樣各酚類物質含量均高于寧夏賀蘭山東麓產區，也可能是因為產區風土條件的不同，河北懷來產區受到季風氣候的影響，四季分明，海拔高的地區氣候比較涼爽，而賀蘭山東麓產區屬于典型的大陸性半濕潤半干旱氣候，晝夜溫差大，空氣濕度小。相同產區酒樣聚類在一起，表明相同年份相同品種的酒樣，產區是影響其風味差異的重要因素，本研究中酒樣中非揮發性物質的含量指標可以作為鑒別酒樣產區的依據。

圖3 不同產區干紅葡萄酒層次聚類分析結果Fig.3 Hierarchical cluster analysis results of dry red wines from different regions

3 結論

本實驗通過對中國三個葡萄酒產區出產的2016年份15款赤霞珠干紅葡萄酒中非揮發風味物質的分析發現，甜味指標（酒精度、還原糖）和酸味指標（總酸、pH、蘋果酸、乳酸、檸檬酸）在不同產區酒樣間差異不顯著（P＞0.05），但酒石酸含量存在顯著性差異（P＜0.05）；而不同產區酒樣的主要苦澀味指標（總酚、總原花青素、黃烷醇、兒茶素、表棓兒茶素、原花青素B1、原花青素B2）存在極顯著性差異（P＜0.01）。

對供試干紅葡萄酒樣非揮發風味物質含量進行主成分分析顯示，原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、黃烷醇、總酸、還原糖、酒精度對呈味特征貢獻較大；經聚類分析顯示，同年份赤霞珠干紅葡萄酒非揮發風味物質的產區聚類結果與酒樣產區來源一致表明可以基于非揮發風味物質實現對葡萄酒產區的判定。