產右旋糖酐酶菌株的篩選、鑒定及酶學性質研究

王芳芳，田小鵬，劉雪芹，祖航天，王 藏，胡 杰，呂明生，王淑軍*

（1.江蘇海洋大學 海洋資源與環境重點實驗室/海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222000）

右旋糖酐酶可以專一水解α-1,6糖苷鍵，應用于輕工業、醫藥等領域。在甘蔗制糖中添加右旋糖酐酶可以降低糖汁黏度，提高蔗糖質量，降低生產成本[1-2]。該酶具有清除口腔微生物產生的牙菌斑，預防齲齒的作用[3-4]。

近年來，酶法降解制備益生元-低聚寡糖具有廣闊的前景。與化學和物理法相比，酶法具有反應條件溫和、產物均一性好、聚合度適中、得率高、無污染、保護產物活性基團等優點[5]。功能性低聚異麥芽寡糖應用于醫藥、食品和養殖等方面[6]。內切右旋糖酐酶水解右旋糖酐產物主要為異麥芽寡糖。LIU X等[7]報道的右旋糖酐酶水解產物中聚合度2～7的低聚異麥芽糖的組分為91.8%，通過體外抗氧化實驗表明，可以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、超氧陰離子和羥基自由基；LIU H F等[8]報道重組菌株GH49右旋糖酐酶水解產物中低聚異麥芽糖的聚合度為3～6，具有促進鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌等腸道益生菌生長和抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌生長的作用。

海洋生態環境具有高鹽、堿性、低溫等特性，海洋微生物可以產生具有新穎特性的酶。本研究從海泥中篩選產右旋糖酐酶的菌株，對其進行形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定，探討菌株生長特性和產酶條件，并采用體外實驗對酶解產物的組成及抗氧化活性進行研究，目的篩選出一株產右旋糖酐酶的海洋細菌，利用其水解產物制備益生元相關產品，為制備異麥芽寡糖提供新的酶源[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

海泥樣品：采集于連云港高公島海域。

1.1.2 化學試劑

藍色葡聚糖（Dextran blue 2000）：美國GE Healthcare公司；微生物裂解液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）：大連Takara公司；裂解酶（TaqPCR Master Mix）：BBI生命科學有限公司；通用引物（27F、1492R）：北京Solarbio科技有限公司；右旋糖酐500鄰苯三酚（焦性沒食子酸）（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母粉（生化試劑）：英國Oxoid公司；魚粉蛋白胨、右旋糖酐20、維生素C（vitamin C，VC）、葡萄糖、麥芽糖（均為分析純或生化試劑）：國藥化學試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：德國BioFroxx公司；麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖（純度＞98%）：日本glycarbo公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、30%過氧化氫（分析純）：南京化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

篩選培養基：酵母粉0.1%，魚粉蛋白胨0.5%，右旋糖酐20 1%，藍色葡聚糖0.2%，瓊脂2%，陳海水配制，pH 8.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

產酶培養基：酵母粉0.1%，魚粉蛋白胨0.5%，右旋糖酐20 1%，陳海水配制，pH 8.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

右旋糖酐酶酶活力測定平板：0.1%藍色葡聚糖，1.5%瓊脂，0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉溶液（pH 5.5）配制。平板凝固后，直接使用。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z生化培養箱：上海博遠迅實業有限公司醫療設備廠；Innova 44R恒溫搖床、Multiskan Go酶標儀、Multifuge X3R高速冷凍離心機：美國Thermo公司；Freezone 6 Plus冷凍干燥機：美國Labconco公司；T100TMThermal Cycler聚合酶聯式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO RAD公司；1200 Infinity series 高效液相色譜（high per formance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產右旋糖酐酶菌株的篩選與鑒定

海泥樣品梯度稀釋10-1至10-6，取50 μL涂布于篩選培養基，30 ℃靜置培養48 h。挑選有透明圈的單菌落純化并保藏。對菌株進行形態學觀察、生理生化指標測定及分子生物學（16S rDNA）鑒定。分子生物學鑒定：提取菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），選用原核微生物通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系為50 μL，擴增條件：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保藏。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海華大基因測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行相似性比較，用MEGA7.0軟件進行同源性分析并通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.3.2 菌株生長特性研究

種子液的制備：菌株接種到種子液培養基，裝液量20%，180 r/min、30℃培養12 h，得到種子液。接種量為2%，180 r/min培養24 h，得到菌懸液，測定其吸光度值（OD600nm值）。

分別以碳源（麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、米糠、葡萄糖）添加量為0.5%、氮源（大豆蛋白胨、牛肉浸膏、魚粉蛋白胨、示蛋白胨和胰蛋白胨為有機氮源，硫酸銨和尿素為無機氮源）添加量為1%、初始pH為5.0～10.0、溫度為20～40 ℃、NaCl含量為0～11%，研究以上因素對菌株生長的影響。

1.3.3 菌株產酶條件優化

裝液量為20%，接種量2%，180 r/min、25 ℃培養48 h。培養液12 000 r/min離心5 min。上清為粗酶液，檢測其右旋糖酐酶的活力。研究不同碳源（麩皮、大麥粉、可溶性淀粉、米糠和馬鈴薯淀粉）（添加量為0.1%）、不同氮源（酵母粉、豆粨、大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨和胰蛋白胨）（添加量為0.5%）、不同溫度培養條件（25～45 ℃）和不同初始pH（5.0～9.0）對菌株發酵產酶的影響。

1.3.4 右旋糖酐酶酶活力的測定方法

采用牛津杯法[10]測定。具體如下：將牛津杯放置在測定平板上，加入100 μL粗酶液，放置恒溫培養箱保溫12 h，檢測透明圈直徑，計算相對酶活，其計算公式如下：

1.3.5 酶學性質

右旋糖酐酶的最適溫度和熱穩定性：將右旋糖酐酶液置于不同溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）反應12 h，測定酶活力。將酶液分別放置在20 ℃、30 ℃、40 ℃和45 ℃分別保溫1 h、3 h、5 h和12 h后，計算相對酶活。

右旋糖酐酶的最適pH和pH穩定性：將右旋糖酐酶液分別放置在不同pH（乙酸-乙酸鈉緩沖液5.0～6.0；磷酸鹽緩沖液6.0～8.0；Tris-HCl緩沖液8.0～9.0）緩沖液配制的平板上，反應溫度20 ℃，12 h后測定酶活力。將酶液分別在20 ℃，pH5.0～9.0條件下保溫1 h后測定酶活，計算相對酶活。

1.3.6 高效液相色譜法檢測酶解產物

酶液與3%右旋糖酐500溶液（pH 6.0，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制）混合，在20 ℃條件下分別反應1 h和3 h。水浴滅酶后，12 000 r/min離心5 min。上清液經3 kDa的超濾管過濾，過0.22 μm的濾膜后用于HPLC檢測。

色譜條件：采用示差折光檢測器Waters600和Waters Sugar-Park1分析柱（6.5×300 mm）對水解產物鑒定和分析。流動相為超純水，流速為0.4mL/min，柱溫70 ℃，進樣量20 μL。標品為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖。

1.3.7 酶解產物抗氧化活性研究

酶解產物經3 kDa超濾后用于檢測。采用半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值反映酶解產物的抗氧化活性，IC50值越小，其抗氧化活性越強。

（1）DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中依次加入150 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液和不同濃度的酶解產物150 μL混勻，室溫條件下反應30 min，12 000 r/min離心3 min，取200 μL的上清液檢測OD517nm值。空白組：用無水乙醇代替樣品組中的DPPH溶液。底物組：用150 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液和150 μL的超純水混勻。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品吸光度值；Ai為空白吸光度值；A0為底物吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中依次加入500 μL Tris-HCl（pH 8.2，50 mmol/L）溶液和不同濃度的酶解產物溶液100 μL混勻，25 ℃溫育10 min，立即加入15 μL的鄰苯三酚溶液（6 mmol/L）反應30 min后，12 000 r/min離心3 min，取上清液。吸取200 μL的上清液檢測OD320nm值。空白組：用稀鹽酸（6 mmol/L）代替樣品組中的鄰苯三酚；底物組：用15 μL的鄰苯三酚溶液和500 μL Tris-HCl以及100 μL超純水混勻。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品的吸光度值；Ai為空白的吸光度值；A0為底物吸光度值。

（3）羥基自由基（·OH）清除率的測定

樣品組：在避光的EP管中添加100 μL不同濃度酶解產物和100 μL 9.9 mmol/L亞硫酸鐵溶液以及100 μL 9.9 mmol/L水楊酸-乙醇、100 μL 8.8 mmol/L雙氧水和1.1 mL去離子水混勻，37 ℃反應15 min后，12 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液檢測OD510nm值。空白組：用100 μL的去離子水替換雙氧水。底物組：用100 μL去離子水替代100 μL的樣品溶液。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：Aj為樣品的吸光度值；Ai為空白的吸光度值；A0為底物的吸光度值。

1.3.8 數據處理與統計分析

實驗設3組平行；采用Origin 8.0軟件進行繪圖制作；結果均使用SPSS 26.0軟件計算并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態學觀察

通過幾輪透明圈法篩選，共獲得4株產透明圈菌株，編號分別為GN01、GN02、GN03和GN04。其中菌株GN02的菌落形態及細胞形態見圖1。由圖1a可知，GN02菌落呈白色、圓形、不透明、表面光滑濕潤、前期邊緣整齊，后期成鋸齒狀、菌落中間有微小凸起。由圖1b可知，菌株GN02為革蘭氏陽性，無鞭毛，有莢膜，有芽孢的長桿菌，菌體大小為（3.00～5.75）μm×（0.8～1.0）μm。

圖1 菌株GN02的菌落（a）和細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain GN02

2.1.2 生理生化試驗

菌株GN02生理生化反應結果見表1。由表1可知，菌株GN02葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、棉籽糖、甘露糖反應結果為陽性，精氨酸脫羧酶反應結果為陰性，其生理生化反應結果與芽孢桿菌屬相符。

表1 菌株GN02生理生化反應結果Table 1 Results of physiological and biochemical reactions of strain GN02

2.1.3 分子生物學鑒定

以提取菌株GN02的DNA為模板，以27F、1492R為引物PCR擴增16S rDNA序列，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物經過純化后，送上海華大基因測序，堿基長度為1 441 bp。

圖2 菌株GN02的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products of strain GN02

利用MEGA7.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株GN02的16S rDNA序列在NCBI上BLAST分析，與Bacillus haikouensis的同源性為97.2%。結合形態學特征和生理生化結果，鑒定菌株GN02為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株GN02的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain GN02 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 菌株GN02的生長特性

各因素對菌株GN02生長影響結果見圖4。由圖4a～圖4e可知，菌株GN02適應多種碳源，其中米糠最佳；大豆蛋白胨為最適氮源；菌株GN02在初始pH 7.0條件下生長效果最佳，在堿性環境中生長較好；菌株GN02在20～40 ℃均生長良好，最適生長溫度為35 ℃，該結果與LAI X H等[11]報道的海洋細菌Catenovulum agarivoransMNH15最適生長溫度相似；該菌在NaCl含量1%～11%范圍內都可以生長，3%為最適生長NaCl含量，在無NaCl時不生長，表明菌株GN02為耐鹽海洋細菌[12]。綜上，菌株GN02生長的最適碳源、氮源、初始pH、溫度和NaCl含量分別為米糠、大豆蛋白胨、7.0、35 ℃和3%。

圖4 各因素對菌株GN02生長的影響Fig.4 Effect of various factors on strain GN02 growth

2.3 菌株GN02的產酶條件

圖5 各因素對菌株GN02產酶的影響Fig.5 Effect of various factors on dextranase production by strain GN02

各因素對菌株GN02產酶條件影響結果見圖5。由圖5a～圖5e可知，菌株GN02產胞外酶，該菌株在不同碳氮源中產酶均較好，其中碳源為麩皮時產酶最高；氮源為大豆蛋白胨時產酶最高；菌株GN02在25 ℃培養條件下產酶最高，隨著培養溫度的升高，產酶下降；在培養基初始pH值為8.0時，菌株GN02產酶量最大；在培養30 h后產酶能力開始大幅提高，48 h時產酶達到最高。該結果與曹研研等[13]報道的真菌產酶時間相比，該菌發酵產酶周期較短。綜上，菌株GN02產酶最適碳源、氮源、溫度、初始pH和時間分別為麩皮、大豆蛋白胨、25 ℃、8.0和48 h。

2.4 酶學性質

圖6 右旋糖酐酶酶學性質測定結果Fig.6 Determination results of enzymatic property of dextranase

由圖6a可知，該酶最適作用溫度為20 ℃，在15～40 ℃之間，可以保持80%以上的相對酶活。由圖6b可知，在20 ℃和45 ℃保溫12 h后，仍然保持90%以上和80%以上的相對酶活。由圖6c可知，該酶最適pH 7.0。由圖6d可知，在pH 7.0緩沖液中保存1 h后，相對酶活保持在90%以上。已報道的右旋糖酐酶最適溫度多在40～60 ℃[14]。NUCHAREE J等[15-17]報道的野生菌株、突變菌株和重組菌產酶的最適作用溫度分別為37 ℃、45 ℃、60 ℃。該右旋糖酐酶最適作用溫度相對較低。低溫酶在工業生產中可以節約能源。

2.5 HPLC檢測酶水解產物

HPLC檢測旋糖酐酶的水解產物，結果見圖7。由圖7可知，水解產物檢測結果顯示，主要產物為異麥芽四糖和異麥芽三糖。其中，1 h水解產物中異麥芽四糖含量為85.6%，異麥芽三糖含量為14.3%；3 h 水解產物中異麥芽四糖含量82.4%，異麥芽三糖含量為13.7%。該酶可用于制備異麥芽寡糖[18]，張宇琪等[19]報道的芽孢桿菌屬產右旋糖酐酶的產物以異麥芽三糖為主。王薔等[20]報道的水解產物主要為異麥芽糖和異麥芽三糖。異麥芽寡糖具有提高免疫力、增殖腸道益生菌，保持食品感官品質和抑制食品中有害菌增長的功效[21-24]。該酶水解產物中異麥芽四糖含量高，具有較好的應用潛力。

圖7 糖標品（a）及酶解產物（b）的HPLC檢測結果Fig.7 Determination results of sugar standards (a) and enzymatic hydrolysis product (b) by HPLC

2.6 酶解產物抗氧化活性

由圖8可知，自由基清除作用隨著多糖質量濃度的增加而增加。清除羥基自由基的效果最好，IC50值為0.42 mg/mL，多糖質量濃度為2.5 mg/mL時清除率為92.7%。清除DPPH的效果次之，IC50值是2.98 mg/mL，多糖質量濃度為10 mg/mL時，最大清除率為84.4%。清除超氧陰離子的IC50值為11.54 mg/mL，在20 mg/mL時的清除率為57.1%。該樣品為聚合度3～4為主的低分子量多糖，分子質量小有利于多糖空間結構的舒展和與自由基的結合，提高抗氧化的能力[25]。

圖8 酶解產物清除自由基的能力Fig.8 Free radical scavenging ability of enzymatic hydrolysis product

LIU X等[7]報道的聚合度2～7為主的低聚異麥芽糖清除超氧陰離子的IC50值約29.04 mg/mL，清除羥基自由基的IC50值約為5.32 mg/mL，IC50值分別是本研究的IC50的2.5倍和12.67倍。

3 結論

本研究從連云港海域的海泥中篩選了一株產內切右旋糖酐酶的海洋細菌，經鑒定菌株GN02為芽孢桿菌。該菌株最適生長溫度和初始pH值分別為35 ℃和7.0。該菌株產胞外酶，最適產酶溫度和初始pH分別為25 ℃和8.0，發酵時間為48 h。酶的最適溫度和pH分別為20 ℃和7.0，具有良好的熱穩定性。酶解產物以異麥芽三糖和異麥芽四糖為主，1 h水解產物中異麥芽四糖含量達到85.6%。酶解產物具有較高的抗氧化活性，清除羥基、DPPH、超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.42 mg/mL、2.98 mg/mL及11.54 mg/mL。該酶在食品和醫藥等領域中具有較大的應用潛力。