響應面法優化復合益生菌發酵枸杞汁的工藝研究

劉知非，周 婷，胡曉磊，劉慧燕*，方海田，潘 琳，胡明珍，李旭陽

（寧夏大學 食品與葡萄酒學院 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）亦稱枸杞子，是茄科枸杞屬的多分支灌木植物，中寧枸杞為寧夏枸杞中的優品[1-3]。研究結果表明，枸杞具有降低膽固醇、減輕動脈硬化、降低血糖等作用[4-6]。不僅能夠有效增強各臟腑的機能[7-10]，還能夠優化腸道菌群，提高人體免疫力[11-13]。諸多研究都印證了枸杞具有極大的營養價值和廣闊的應用前景。

對于枸杞發酵也有很多報道，喬博鑫等[14]研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發酵枸杞過程中理化指標及風味物質的變化，從發酵后的枸杞液中分離出酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、芳香雜環類共63種揮發物質；吳昊等[15]以石榴、枸杞為主要原料釀造石榴枸杞酒，并對其發酵工藝進行了響應面優化分析，制成的石榴枸杞酒的酒精度達到9.94%vol，酒體醇厚、酒味怡人、口感尚佳；李彩霞等[16]利用葡萄和枸杞為主要原料，接種酵母菌及醋酸菌發酵釀造復合果醋，制成的果醋中總酸（以醋酸計）為4.27 g/100 mL，還原糖（以葡萄糖計）為2.5 g/L，產品風味純正，具有特殊的水果香味及較高的營養價值；楊電增等[17]利用響應面優化山藥枸杞酸奶最佳生產工藝參數為山藥漿添加量7.64%、枸杞粉添加量0.40%、蔗糖添加量8.56%、發酵劑接種量0.21%，此條件下得到的山藥枸杞酸奶在總可溶性固形物、蛋白含量、脂肪等指標均高于國家規定的理化值且感官評價良好。但現在的研究多是基于單一菌種通過發酵工藝優化得到的純種發酵產品，其營養物質及風味物質的種類單一且含量有限，在發酵過程中嚴重受到菌種自身制約。雖可對其進行工藝優化，但對營養及風味物質的增加與豐富影響有限，影響了發酵產品的進一步升級優化。多菌種復合發酵通過利用菌種之間的代謝組學多樣性和生長特性，為解決發酵產品中產物種類單一、產物產量有限、菌種自身瓶頸等問題提供一定的參考。

本研究采用新鮮寧夏枸杞干果，加水磨漿后，接入腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌進行發酵。通過單因素及響應面試驗優化發酵枸杞汁的最佳工藝參數，以期為復合益生菌發酵枸杞汁的實際應用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞（特優級，≤280粒/50 g）：市售；小蘇打、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室保藏；D-異抗壞血酸鈉：江西省德興市百勤異VC鈉有限公司；氫氧化鈉：天津市北聯精細化學品開發有限公司；酚酞：天津市大茂化學劑廠；MRS肉湯、MRS固體培養基：北京陸橋技術股份有限公司；蘆丁標準品（純度＞98%）、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白：北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

V-5100紫外分光光度計：上海精科實業有限公司；RZ-988e Royalstar 打漿機：合肥榮事達小家電公司；PLD-HDE2.0手持糖量計：陜西普洛帝測控技術有限公司；PB-LO pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；LRH-150-B生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合益生菌發酵枸杞汁工藝流程及操作要點

取出在-80 ℃條件下甘油保藏的4種菌株（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、腸膜明串珠菌、植物乳桿菌），解凍至室溫。在無菌操作臺上進行平板劃線，隨后置于生化培養箱中37 ℃恒溫培養8～10 h，重復操作3次，使其充分活化。在無菌條件下挑取單菌落，接種到MRS液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養8～10 h后取出，獲得發酵用菌懸液。

挑除枸杞干果中的爛果、霉果，用自來水沖洗表面，去除雜質后按一定的料水比加入蒸餾水，加入0.15 g/kgD-異抗壞血酸鈉，混合均勻，封口置于干燥陰涼處浸泡10～12 h后進行打漿，并用無菌紗布過濾。隨后向濾液中加入5%的白砂糖，用小蘇打調pH至6.5～7.0后巴氏殺菌（65 ℃、30 min）。待枸杞汁冷卻至30～35 ℃后進行分裝，接種一定比例制備好的菌懸液，37 ℃恒溫培養一定時間，終止發酵后放入4 ℃冰箱冷藏。

1.3.2 單因素試驗

固定其他條件，以感官評分和乳酸含量為評價指標，分別考察復合益生菌配比（植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶2、1∶3∶3∶3、2∶1∶2∶3、3∶3∶2∶1，V/V）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL））、接種量（3%、4%、5%、6%、7%）和發酵時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對發酵枸杞汁品質的影響。

1.3.3 響應面試驗優化

在單因素試驗的基礎上，以料水比（A）、接種量（B）、發酵時間（C）為3個考察因素，發酵枸杞汁的感官評分（Y）為考察指標，利用Design-Expert v8.0.6.1軟件進行Box-Behnken響應面分析和優化，響應面試驗因素與水平見表1[19]。

表1 發酵枸杞汁發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

乳酸含量：參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[20]；乳酸菌菌落數：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[21]；總糖：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》[22]；總黃酮：參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》[23]；蛋白質：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[24]；致病菌：參照GB 4789.6—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[25]。

感官評價：由10名不同年齡、性別、具有豐富評定經驗的專業人員組成評定小組，從發酵產品的口感、組織狀態、色澤、香氣4個方面綜合進行評定，滿分為100分，取平均分進行評定。發酵枸杞汁感官評分標準見表2。

表2 發酵枸杞汁感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Lycium barbarum juice

續表

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 菌種比例對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

圖1 復合益生菌配比對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.1 Effect of composite probiotics ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖1可知，隨著復合益生菌配比的變化，發酵枸杞汁乳酸含量為370～430 mg/100 mL，表明所有復合益生菌配比均可較好地使菌種利用體系中的可發酵糖進行乳酸的積累。雖然各水平間乳酸含量較為接近，但感官評分差異較大。可能是由于菌種之間生長和代謝特性不同，不同時期發酵枸杞汁中的主導菌群不同，從而影響揮發性物質的種類和含量，最終導致感官評分出現較大差異。當植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1時，乳酸含量為429 mg/100 mL，感官評分達到85分。綜合考慮，確定最佳復合益生菌配比為植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1（V/V）。

2.1.2 料水比對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

圖2 料水比對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖2可知，發酵枸杞汁乳酸含量隨料水比中水含量的增加而增加，可能是因為在一定范圍內水含量的增加有助于提高多糖等營養物質的擴散傳質效率，提高浸出率[26]，使得乳酸菌更易于利用底物產生乳酸。料水比為1∶10（g∶mL）時，發酵枸杞汁中乳酸含量為439 mg/100 mL，當料水比為1∶12（g∶mL）時，乳酸含量達到448 mg/100 mL。

隨著水含量的增加，發酵枸杞汁的感官評分先升高后降低，料水比為1∶10（g∶mL）時，感官評分最高達83分。綜合考慮，選取料水比1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL）進行后續響應面試驗。

2.1.3 接種量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

圖3 接種量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖3可知，發酵枸杞汁乳酸含量隨接種量的增加而增加，在接種量達到6%時，乳酸含量為432 mg/100 mL；在接種量達到7%時，乳酸含量為最大值485 mg/100 mL。在接種量為6%～7%時，乳酸含量上升幅度較小，可能是由于負責產生乳酸的菌體由于發酵后期發酵枸杞汁中可發酵性糖的缺乏，不能維持菌體生長，在競爭中處于劣勢，逐漸喪失優勢菌種地位。

隨著接種量的增加，發酵枸杞汁的感官評分先升高后降低，接種量為5%時，感官評分最高達88分。綜合考慮，選取接種量4%、5%、6%進行后續響應面試驗。

2.1.4 發酵時間對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

圖4 發酵時間對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，發酵枸杞汁乳酸含量呈逐漸增加趨勢，在發酵時間6～8 h時，乳酸含量增幅最大，為150 mg/100 mL。可能由于在此時間段內，菌體加速生長繁殖進入對數生長期，發酵枸杞汁中可發酵性糖的消耗速率大大增加，乳酸含量大幅上升。8 h后菌體生長進入穩定期，菌體生長代謝速度放緩，乳酸含量增幅不顯著。發酵10 h時，發酵枸杞汁乳酸含量最大，為485 mg/100 mL。

隨著發酵時間的延長，發酵枸杞汁感官評分呈先上升后下降的趨勢。在發酵進行到8 h時，發酵枸杞汁感官評分最高，達89分。綜合考慮，選取發酵時間6 h、8 h、10 h進行后續響應面試驗。

2.2 發酵工藝優化響應面試驗

枸杞汁發酵條件優化響應面試驗結果見表3，根據表3進行多元回歸擬合，得到響應面回歸模擬方程為：Y=94.60-6.38A+5.13B-5.75C+4.25AB-1.00AC+2.50BC-7.68A2-6.17B2-14.43C2

表3 枸杞汁發酵條件優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken design for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization

表4 以感官評分為響應值的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis with sensory score as response value

由表4可知，該模型P＜0.01，說明該模型極顯著；失擬誤差P＞0.05，說明沒有產生失擬現象。校正決定系數R2adj為0.972 7，表明有約97.27%的感官評分由此模型進行解釋；方程的決定系數R2為0.988 0，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。各項方差分析表明，一次項A、B、C，交互項AB，二次項A2、B2、C2對感官評分有極顯著影響（P＜0.05）；交互項BC對感官評分有顯著影響（P＜0.05）；交互項AC對感官評分影響不顯著。模型的F值可以反映各因素對試驗響應值的重要性，F值越大，表明對試驗響應值的影響越大，重要性越大[27]。根據F值大小可知，各因素對乳酸含量影響的主次因素為A＞C＞B，即料水比＞發酵時間＞接種量。

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示2個因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[28-29]。由圖5可知，AB、BC交互作用存在最大值，交互作用顯著（P＜0.05），AC交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖5 料水比、接種量、發酵時間交互作用對發酵枸杞汁感官評分影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of solid-liquid ratio,inoculum and fermentation time on sensory evaluation of fermented mash

復合益生菌發酵枸杞汁的最佳工藝為料水比1∶9.35（g∶mL），接種量5.26%，發酵時間7.67 h，在此條件下，復合益生菌發酵枸杞汁感官評分預測值為97.172 3分。考慮試驗可操作性，修正最佳工藝條件為：料水比1∶9（g∶mL），接種量5%，發酵時間8 h。在此條件下，復合益生菌發酵枸杞汁的感官評分達到96分，與預測值接近。說明模型擬合性良好，驗證了模型的有效性。

2.3 發酵枸杞汁品質分析

制得的發酵枸杞汁的最終pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌數為2.3×108CFU/mL，總糖含量為155 mg/100 mL，總黃酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白質含量0.2 g/100 mL。

3 結論

以寧夏枸杞干果為原料，利用多種乳酸菌對枸杞汁進行混合發酵，得出最優發酵條件為復合益生菌配比植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=3∶3∶2∶1（V/V），料水比1∶9（g∶mL），接種量5%，發酵時間8 h。在此優化工藝條件下制得的發酵枸杞汁的最終pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌數為2.3×108CFU/mL，總糖含量為155 mg/100 mL，總黃酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白質含量0.2 g/100 mL。該飲料為橘紅色，色澤明亮，酸甜平衡，具有枸杞的特征滋味，感官評分達到96分。