通過生物信息分析篩選腎上腺皮質癌的關鍵生物標志物和治療靶點

胡丹飛，陳曉東，項振飛

腎上腺皮質癌（ACC）是一類起源于腎上腺皮質的罕見惡性腫瘤，其發病年齡呈現雙峰趨勢，即兒童以及40 ～60 歲為高峰年齡[1-2]。腎上腺皮質腺癌的惡性程度高，生存時間短，局限期的5 年生存率為60%～80%，局部進展的5 年生存率為35%～50%，而遠處轉移的5 年生存率僅為0 ～28%[3]。手術是ACC 根治的首選的唯一手段，但多數患者確診時已失去根治手術的機會，可見ACC的早期診斷與治療是提高患者生存率的關鍵因素。微陣列和高通量測序技術能夠對疾病基因進行大規模的篩選，并進行差異表達鑒定，從而研究疾病的發生和發展機制。基因表達綜合數據庫（GEO）是目前收集世界各地研究機構基因表達數據的公共數據庫[4]。本文基于生物信息分析的方法，通過GEO 數據庫下載關于ACC的基因表達數據，并對其進行分析，從而鑒定在ACC發生與發展過程中的關鍵基因，報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據集的收集與分析 從GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因表達芯片GSE19776和GSE143383。GSE19776 數據中包含4 個正常腎上腺組織和44 個ACC組織；GSE143383 包含4 個正常腎上腺組織和58 個 ACC 組織。基于 GEO 在線分析工具GEO2R（http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）對兩組芯片數據進行正常組與ACC腫瘤組差異表達分析，其中以調整P＜0.05、|logFC|≥1.5 為差異基因的篩選條件。并對兩組數據的差異基因取交集進行下一步分析。

1.2 基因富集分析 利用在線分析網站webgestalt（http://www.webgestalt.org）對差異基因進行 Gene Ontology（GO）基因富集分析及KEGG 信號通路富集分析，并以P ＜0.05 為差異統計學有意義。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）及核心（Hub）基因的篩選 利用PPI在線分析工具STRING（http://stringdb.org）對差異基因進行分析，將PPI＞0.4 認為有意義。隨后用Cytoscape 軟件對string 分析結果進行可視化展現，并分別以自由度（dgree）≥13、dgree≥8 篩選上調及下調差異基因的Hub 基因。

1.4 Hub基因的診斷與預后分析 利用在線分析網站GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）對 Hub 基因進行表達驗證、生存分析及病理分期分析。

2 結果

2.1 差異基因的篩選 GSE19776 、GSE143383 數據集差異基因分別為705 及433 個，共同差異基因為134 個。其中119 個為下調共同差異基因及15個上調共同差異基因。

2.2 差異基因富集分析 生物過程主要集中于再生、心肌細胞發育、器官重建及對無機物的反應等；信號通路主要集中在補體系統、黃體酮介導的卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂等。見封二彩圖1。

2.3 PPI網絡圖的構建及Hub 基因的篩選 上調差異 Hub 基因分別為 RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1；下調差異基因的 Hub 基因為IGF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF。見封二彩圖2。

2.4 Hub 基因的臨床診斷與判斷預后價值 上調Hub基因在臨床樣本中均呈現在腫瘤組織中高表達，而下調Hub 基因呈下調趨勢，見封二彩圖3。在上調Hub基因高表達的患者中總體生存率低于低表達患者，而下調Hub 基因低表達患者生存率低于高表達患者，見封三彩圖1。上調Hub 基因其與病理分期的一致性較好，即隨著腫瘤的進展其表達也呈現上升趨勢。而在下調Hub 基因中盡管一致性不如上調Hub 基因，但在晚期患者即3、4 期的病理分期樣本中也出現了下調趨勢，見封三彩圖2。

圖1 差異基因富集分析

圖2 PPI 網絡圖和Hub 基因的篩選

圖3 Hub 基因在ACC 腫瘤中與正常腎上腺組織中的表達比較

圖1 Hub 基因的生存分析

圖2 Hub 基因與ACC 病理分期的相關性分析

3 討論

ACC為罕見的惡性腫瘤，在世界范圍及每年發病率為（0.5 ～ 2）/百萬[5]。ACC 具有高度的侵襲性，因此預后較差。但是基于目前研究仍無ACC 特異的診斷標記物，其腫瘤發生及發展的機制尚不完全清楚。因此急需新的分子標志物來預測ACC 患者的疾病分期和臨床結果，并為將來的個性化治療提供依據。

本文通過GEO數據庫在Hub 基因的篩選發現上調Hub 基因有RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1；下調 Hub 基因有 IGF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF。并且在 GEPIA 數據庫中得到證實，與患者的病理分期及生存率均存在相關性。部分基因在過往的研究中證實與腫瘤存在密切關系。如Subramanian 等[6]發現，在相比較于早期ACC患者，在IV 期中參與DNA 損傷和細胞周期通路的基因表達上調。本文還發現與細胞周期相關的蛋白如CDK1、CCNB1、MAD2L1 均上調，這可能與ACC的進展呈相關性。RACGAP1 可促進細胞增殖及胞質分裂，并被發現在多種惡性腫瘤如肝癌、胃癌、食管癌中均高表達[7-9]。TYMS 可編碼胸苷酸合酶可促進DNA 復制并在腫瘤的發生過程中起重要作用[10-11]。研究發現NCAPG 為肝癌的致癌基因，在腫瘤中通過激活 PI3K/AKT/FOXO4 通路促進細胞增殖和抗凋亡的作用[12]。本文在下調Hub 基因中發現在過往的研究中TGFBR2 的缺失通常與腫瘤的發生相關，如在缺氧的狀態下EZH2 可促進TGFBR2 的啟動子超甲基化使其表達降低，從而使前列腺癌進展及轉移[13]。在間充質干細胞中TGF- 可通過抑制CXCL12的表達促進乳腺癌的轉移[14]。

綜上所述，RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1、IGF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF基因與ACC的發生與發展存在相關性，為將來ACC的診斷以及相關靶向治療選擇提供了部分依據。但本文基于過往的 ACC 患者基因芯片數據進行分析，存在局限性，仍需包括基礎研究及臨床試驗進一步驗證其相關性并揭示相關基因作用的具體機制。