缺失突變型HBx 蛋白介導PDK2 在肝細胞肝癌中的差異表達及機制

張晶，畢利泉，曹瑞雪，姜貝貝，張自成，劉曉紅

1 山東省立第三醫院，濟南250031；2 中國人民解放軍聯勤保障部隊第960醫院；3 深圳市中醫院 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院

肝細胞肝癌（HCC）是我國第4 位常見的惡性腫瘤，其主要發病危險因素是乙型肝炎病毒（HBV）感染［1］。大量研究顯示，乙型肝炎病毒X（HBx）基因編碼的HBx 蛋白可以促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，從而加速肝癌的發展［2］。既往我們檢測HCC 患者的肝癌組織及非癌性肝組織，發現HBx 蛋白羧基端的缺失突變是HBV相關HCC中的頻發事件，并發現了一個HBx基因的天然缺失突變體HBx-128w，導致HBx 蛋白羧基端129-154aa 的缺失［3］。體外實驗證實，缺失突變型HBx-128w較之野生型HBx具有更強的促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用［4］。2012 年3 月—2016 年10 月，我 們 構 建 了含HBx-128w 序列的真核表達載體，以空載體pcDNA3.1 為對照組，分別轉染人肝癌細胞系Huh7，利用長鏈非編碼RNA（lncRNA）芯片篩選相關差異表達基因，并初步探討HCC 中差異基因丙酮酸脫氫酶激酶2（PDK2）表達的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系Huh7購自中國科學院細胞庫；重組表達載體pcDNA3.1-HBx-128w 購自上海銳賽生物技術有限公司；真核表達載體pcDNA3.1和脂質體LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；鼠抗HBxAg 單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的鼠抗兔IgG 二抗、ECL 化學發光檢測試劑盒購自美國Santa Cruz 公司；兔抗PDK2 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購自上海碧云天公司；G418 培養液、胎牛血清、DMEM 培養液、Opti-MEM 培養液、胰蛋白酶、購自美國Gibco BRL 公司；聚偏二氟乙烯膜、Western 電轉移系統購自美國Bio-Rad 公司；lncRNA Array v3.0 芯片購自美國Arraystar 公司；Trizol 試劑、SuperScriptTMⅢ逆轉錄酶購自美國Invitrogen 公司；RNeasy Mini Kit 試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.2 細胞轉染與穩定轉染細胞株的篩選 Huh7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，添加1%的青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，隔天換液1 次，3～4 d 傳代1 次。轉染前24 h 用0.25%胰蛋白酶和0.02%二乙胺四酸二鈉消化對數生長期的Huh7 細胞，以每孔3×105個接種于6 孔板，隨機分為pcDNA3.1 組和HBx-128w 組，每組設3個復孔，轉染前1 h 更換為Opti-MEM 培養液。取1μg 待轉染質粒加入100μL Opti-MEM 培養液中混勻，室溫孵育10 min；取3 μL Lipofectamine 2000試劑加入100 μL Opti-MEM培養液中混勻，室溫孵育5 min；將兩種稀釋液充分混勻，室溫靜置30 min，加入DMEM培養液至1 mL。棄去6 孔板培養液，每孔加入1 mL轉染液，置于培養箱中培養4 h。加入含20%胎牛血清的DMEM 培養液1 mL，24 h 后更換新鮮培養液。轉染48 h 后，取1/3 的細胞加入含800 μg/mL G418的培養液，篩選出抗性克隆，之后降低G418 濃度至400 μg/mL維持擴大培養抗性克隆細胞。

1.3 細胞HBx 蛋白表達檢測 采用SDS-PAGE 凝膠電泳及Western blotting法。取單層生長的兩組穩轉Huh7細胞及未轉染Huh7細胞，PBS洗2次，加入SDSPAGE上樣緩沖液，冰上孵育20 min，12 000 r/min離心2 min，收集上清。98 ℃水浴變性5 min，加樣至10%的SDS-PAGE 凝膠加樣孔內電泳（120 V）。使用電轉移系統將分離膠上的蛋白質轉移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入鼠抗HBxAg 單克隆抗體（1∶200），β-actin（1∶1 000）作為內參，4 ℃過夜。次日加入HRP 標記的二抗37 ℃孵育1 h，ECL 化學發光檢測試劑盒顯影成像。

1.4 細胞mRNA表達的LncRNA芯片檢測 lncRNA Array v3.0 芯 片 包 括來 自Refseq、Gencode、UCSC knowngenes 等權威數據庫和文獻報道中的lncRNA，樣本制備和芯片雜交根據制造商的標準協議進行。取穩轉細胞1×106～1×107個，加入RNA 抽提試劑Trizol，裂解細胞后抽提總RNA。利用NanoDrop ND-1000 分光光度計和標準變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性和濃度。然后利用隨機引物法，將每個樣本擴增并轉錄成熒光cRNA。用RNeasy Mini Kit 試劑盒對標記的cRNA 進行純化，將標記的cRNA 雜交到lncRNA 芯片上，芯片在65 ℃的滾動雜交爐Agilent Hybridization Oven 中孵育17 h。使用Agilent DNA 微陣列掃描儀掃描芯片，Agilent Feature Extraction 軟件提取芯片數據，Agilent Gene Spring GX v11.5.1 軟件進行原始數據的歸一化和后續分析。篩選標準為Fold Change≥2.0及FDR≤0.05。

1.5 細胞PDK2 表達檢測 采用RT-qPCR 方法，選取差異表達基因PDK2在穩轉細胞中進行驗證。利用Trizol 試劑及SuperScriptTMIII 逆轉錄酶進行樣本總RNA的抽提及cDNA的合成，實時定量PCR反應在ViiA 7 Real-time PCR System 進行，引物設計軟件Primer 5.0 設計雙向引物序列如下：PDK2，F：5'- TCCAGCAATGCCTGTGAGAAA-3'和R：5'-TCGGGAAGCAGGTTGATCTC-3'；GAPDH，F：5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'和R：5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。根據梯度稀釋DNA 標準曲線，各樣本PDK2 和GAPDH 基因的濃度結果直接由機器生成，數據采用2-ΔΔCT法進行分析，重復3次。

1.6 PDK2 相關調控lncRNA 的生物信息學預測及驗證 根據互作基因共表達網絡尋找可能相關的lncRNA，并利用RT-qPCR 方法在穩轉細胞中進行驗證，引物設計軟件Primer 5.0設計引物序列如下：lncRNA ENST0000511361，F：5'-TCCTGCTTAACCCTGCATTT-3'和R：5'-GGCAGTGATGTGGAGTCAGA-3'。其余步驟同前。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩轉細胞HBx 蛋白表達 HBx-128w 轉染組Huh7 細胞檢測到HBx 陽性條帶，而pcDNA3.1 空載體組和未轉染組Huh7細胞無此條帶，說明HBx蛋白在HBx-128w轉染組Huh7細胞內高表達。見圖1。

圖1 兩組細胞HBx蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.2 兩組細胞mRNA 的差異表達 HBx-128w 組及空載體pcDNA3.1 組穩轉細胞中共檢測出mRNA 24 976個，lncRNA 36 629個。與pcDNA3.1組相比，HBx-128w 組差異表達的mRNA 數量為2 937 個，其中上調1 123 個（Fold Change：2.01～15.81），下調1 814 個（Fold Change：2.00～92.17）。 與pcDNA3.1 組相比，HBx-128w 組差異表達的lncRNA 數量為8 057個，其中上調2 986個（Fold Change：2.00～2578.19），下 調5 071 個（Fold Change：2.00～99.98）。在這些差異表達的mRNA中，PDK2顯示為上調表達，Fold Change為3.219。

2.3 兩組細胞PDK2 差異表達 RT-qPCR 結果顯示，HBx-128w 組和pcDNA3.1 組PDK2 的相對濃度分別為4.823±0.497 和1.343±0.061；與pcDNA3.1組相比，HBx-128w 組PDK2 的濃度升高（P＜0.05），兩組間差異倍數為3.591。

2.4 PDK2 相關調控lncRNA 的差異表達 RT-qPCR 結果顯示，HBx-128w 組和pcDNA3.1 組lncRNA ENST0000511361 的相對濃度分別為4.790±0.364和1.280±0.066，與pcDNA3.1 組相比，HBx-128w 組lncRNA ENST0000511361的濃度升高（P＜0.05），兩組間差異倍數為3.742，與PDK2差異表達的趨勢一致。

3 討論

研究表明，HBx 蛋白的氨基端（1-50aa）是負功能調控區，可以抑制HBx 蛋白的反式激活功能，而羧基端（51-154aa）為反式激活區，該區域的105-148aa是HBx 蛋白發揮反式激活功能的結構基礎［5］。肝癌組織中普遍存在著異質的HBx 羧基端缺失突變體，表達截短的HBx 蛋白，導致其反式激活能力下降，同時喪失了野生型HBx 抗增殖和促細胞凋亡以及抑制細胞轉化的作用［6］。HBx 蛋白任何區域的缺失都可能改變其與細胞增殖、轉化、反激活或轉錄調控相關的生物學功能。之前我們構建了不同長度的HBx 羧基端缺失突變體，結果顯示它們對肝癌細胞的生物學行為有著不同的影響［7］。對人HCC組織中HBx 羧基端缺失突變體的研究顯示，與野生型HBx 相比，缺失突變體通過復雜的分子調控網絡促進了肝細胞的惡性轉化［8］，但是其確切的分子機制仍需深入研究和充分闡明。

相關研究表明，即使在氧含量正常的情況下，腫瘤細胞也以糖酵解途徑作為主要的能量來源［9］。丙酮酸脫氫酶激酶（PDKs）作為有氧糖酵解途徑的重要調節酶，在某些病理條件下被激活，可能通過影響有氧糖酵解改變細胞的代謝，參與細胞的惡性轉化。PDKs 有PDK1、PDK2、PDK3、PDK4 四種亞型，其中PDK2 幾乎在所有組織中表達，尤其是肝臟和腎臟［10］。近年來，PDK2 與腫瘤的關系受到關注。研究顯示，PDK2 在多種腫瘤中異常過表達，與腫瘤的惡性表型密切相關［11］。一項研究發現，PDK2 在膽管癌組織中強陽性表達，在癌旁組織中呈弱陽性表達，兩者有顯著差異［12］。本研究的lncRNA芯片結果顯示，PDK2 在缺失突變型HBx 轉染的Huh7 細胞中上調表達；之后的RT-qPCR 試驗結果顯示，與空載體pcDNA3.1 組相比，HBx-128w 組穩轉細胞中PDK2 的表達顯著上調，這與芯片結果一致，提示HCC 組織中，缺失突變型HBx 參與調控了PDK2 在轉錄水平的表達，可能通過改變肝癌細胞的代謝，加速了HCC的演進。

PDK2 調控腫瘤發展的機制涉及多個方面。有研究發現，PDK2 在HCC 中高表達，與miR-214 呈負相關，下調PDK2 可以顯著抑制HCC 細胞的增殖和遷移［13］。還有人發現，抑制PDK2 活性可以抑制磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 通路的激活，從而抑制腫瘤細胞的生長［14］。現有對PDKs 抑制劑的研究發現，PDK2 的過表達是癌細胞獲得性耐藥的重要機制，下調PDK2 能夠提高癌細胞對化療藥物的敏感性［15］。lncRNA 是一種長度超過200 個核苷酸、編碼蛋白能力較低或不具有編碼蛋白能力的RNA 轉錄本［16］，具有復雜的二級空間結構，可以為蛋白質提供多個結合位點，形成復雜精細的基因表達調控網絡?，F有研究表明，lncRNA 與人類腫瘤密切相關，lncRNA 的異常表達在包括HCC 在內的許多腫瘤中都有發生［17］。目前已發現多種lncRNA 在HBV 相關的HCC中異常表達，參與調控HCC的發展［18］。大部分研究也表明lncRNA受到HBx的調控；通過加速腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，或通過調節多種蛋白編碼基因、miRNA 和信號通路的表達來減少細胞凋亡，從 而 促 進HCC 的 進 展［19-20］。本 研 究 通 過 對mRNA 和lncRNA 表達譜的交集分析和生物信息學預測，發現lncRNA ENST0000511361 可能參與HCC發展過程中PDK2 表達的調控，RT-qPCR 結果顯示HBx-128w 組穩轉細胞中lncRNA ENST0000511361表達量較pcDNA3.1 組明顯升高，這與PDK2 的RTqPCR 結果一致。未來我們將通過體外實驗對該lncRNA的功能進行深入研究。

綜上所述，我們利用lncRNA芯片篩選了缺失突變型HBx 轉染的肝癌細胞中差異表達的基因，發現了PDK2 在Huh7 細胞中上調表達，并通過RT-qPCR驗證了芯片結果。提示HCC 組織中，HBx 蛋白可以通過羧基末端的缺失突變，改變其生物學功能，調控PDK2 的異常表達，促進HCC 的發展。這一過程涉及到許多因素，其中lncRNA ENST0000511361 可能是一個重要的調控靶點。