miR-650在潰瘍性結腸炎患者血漿中的表達水平及其與預后的關系

何 英 張慧華 吳小明

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病，具有復發率高、預后差的特點[1]。目前UC的發病機制尚未完全闡明，多數學者認為其與基因、免疫功能及外源性物質引發的宿主反應等有關[2]。近年來，中國UC的發病率呈升高趨勢[3]。及早了解UC預后情況，對于臨床醫師制定治療方案及改善患者預后均有重要意義，然而，目前尚缺乏有效的指標用以評估UC患者的預后情況。微RNA(miRNA)是一種不具備編碼蛋白質功能的單鏈RNA，由18～24個核苷酸組成，多種miRNA已被證實參與了UC發病及進展的過程[4-5]。有報道指出，miR-650可參與神經膠質瘤[6]、甲狀腺癌[7]、肝細胞癌[8]、非小細胞肺癌[9]、慢性淋巴細胞性白血病[10]及阿爾茨海默癥[11]等的發病及進展過程。此外，近年來有研究報道miR-650可靶向核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白6，促進炎性反應誘導的腸上皮細胞凋亡，從而參與UC的發病及進展[12]。本文探究了miR-650與UC患者預后的關系，以期為UC的預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2017年3月至2019年10月在浙江衢化醫院就診的117例UC患者作為研究對象。參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[13]診斷UC。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)確診為UC；(3)能夠配合完成治療及相關檢查；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并除UC以外的自身免疫性疾病；(2)就診前3個月內服用抗炎藥物或免疫抑制劑；(3)合并感染性疾病，如急性胃腸炎；(4)嚴重肝、腎功能異常；(5)有UC相關并發癥，如結腸大出血、UC相關黏膜異常增生等；(6)合并惡性腫瘤；(7)合并類風濕關節炎、心力衰竭等。117例UC患者中男性58例，女性59例，年齡24～45歲，平均年齡為(37.42±4.26)歲。本研究經浙江衢化醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 信息收集

收集所有受試者的年齡、性別、病變范圍、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及UC內鏡下嚴重度指數(UCEIS)等信息。使用ALIFAX Test 1型全自動快速血沉分析儀(購自意大利ALIFAX公司)檢測ESR，采用酶聯免疫吸附測定法檢測CRP、IL-1β和IL-6的表達水平。根據受累腸段最嚴重處的血管紋理、出血情況、糜爛和潰瘍程度計算UCEIS。血管紋理：血管紋理正常記0分，血管斑片狀記1分，血管完全閉塞記2分；出血情況：黏膜和腸腔無出血記0分，黏膜和腸腔輕度出血記1分，黏膜和腸腔中度出血記2分，黏膜和腸腔重度出血記3分；糜爛和潰瘍程度：無糜爛和潰瘍記0分，糜爛記1分，淺表性糜爛和潰瘍記2分，深部糜爛和潰瘍記3分。以上3項評分之和為UCEIS評分[14]。

1.3 治療方案

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[13]治療UC，治療方案主要包括糾正水、電解質紊亂，貧血及低蛋白血癥等；對于輕、中度UC患者給予5-氨基水楊酸(5-ASA)治療；對于5-ASA療效不佳的中、重度UC患者給予糖皮質激素或英夫利昔單抗治療；對于頻繁復發及激素依賴的UC患者加用免疫抑制劑治療。

1.4 預后評估

采用復診方式了解UC患者的預后。患者于治療后3個月行結直腸鏡檢查，以評估預后情況。本研究將治療后3個月時愈合欠佳(黏膜血管紋理不清，伴有水腫、充血、糜爛或潰瘍等)、復發(黏膜愈合后再次出現UC相關癥狀，如腸黏膜血管紋理不清、出血、糜爛或潰瘍等)、并發結腸大出血、中毒性巨結腸、UC相關黏膜異常增生、癌變及接受腸切除手術治療定義為預后不良。

1.5 血漿miR-650表達水平檢測

實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time qPCR)法檢測UC患者血漿miR-650的表達水平[15]。具體步驟：在治療前及治療后(用藥2周)分別抽取UC患者肘部靜脈血10 mL，4 000 r/min離心10 min，提取上層清液；使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，然后取2 μg總RNA至反轉錄試劑盒中，反應生成cDNA；最后使用PCR儀進行擴增反應，反應條件為95 ℃預變性5 min，之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計35個循環。內參為U6。ΔCt=CtmiR-650-CtU6，采用2-ΔΔCt表示miR-650的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 UC患者的預后情況

117例UC患者中有44例(37.61%)預后不良，其中18例(15.38%)黏膜愈合欠佳，22例(18.80%)復發，1例(0.85%)并發結腸大出血，3例(2.56%)接受腸切除手術治療。

2.2 預后良好組和預后不良組的基本資料比較

根據UC患者的預后情況將其分為預后良好組(n=73)和預后不良組(n=44)。兩組在年齡、性別、IL-1β、IL-6、ESR和病變范圍方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。與預后良好組相比，預后不良組CRP、UCEIS評分及應用糖皮質激素的比例均較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.3 預后良好組和預后不良組血漿miR-650表達水平比較

117例UC患者中初始治療方案采用5-ASA的有44例，38例采用糖皮質激素，4例采用英夫利昔單抗，31例采用糖皮質激素+免疫抑制劑。接受上述4種方案治療后的血漿miR-650表達水平分別為0.50±0.16、0.57±0.18、0.43±0.10和0.58±0.16，差異無統計學意義(F=2.192，P=0.093)。

預后良好組和預后不良組治療前血漿miR-650表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。兩組治療后血漿miR-650表達水平均較治療前降低，且預后良好組血漿miR-650表達水平低于預后不良組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組的基本資料比較

表3 兩組血漿miR-650表達水平比較

2.4 血漿miR-650診斷UC預后的效能

治療前miR-650診斷UC預后的ROC曲線下面積(AUC)、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.529(95%CI：0.435～0.622)、1.14、50.00%和61.64%。治療后miR-650診斷UC預后的AUC、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.865(95%CI：0.790～0.921)、0.58、88.64%和82.19%。結果顯示，治療后miR-650診斷UC預后的效能高于治療前miR-650，差異有統計學意義(Z=5.117，P<0.001)。見圖1。

2.5 影響UC患者預后的因素

將可能與UC患者預后有關的因素如CRP、UCEIS評分、初始治療方案(應用糖皮質激素)和血漿miR-650(治療后)作為自變量，將UC患者的預后情況作為因變量，納入多因素Logistic回歸分析模型，結果顯示UCEIS評分、初始治療方案和血漿miR-650均是UC預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

圖1 血漿miR-650診斷UC預后的ROC曲線

表4 影響UC患者預后的Logistic回歸分析

2.6 血漿miR-650與UC預后的關系

采用限制性立方樣條擬合Logistic回歸模型分析血漿miR-650與UC預后的關系，當節點個數為5時，AIC值最小，AIC=102.698。分析結果顯示miR-650表達水平與UC預后有關(χ2=37.33，P<0.001)，且呈非線性關系(χ2=10.98，P=0.012)。以治療后miR-650評估UC預后的最佳截斷值作為參考，即與miR-650=0.58時比較，當miR-650<0.58時，患者發生預后不良風險降低；當miR-650>0.58時，患者發生預后不良風險升高。見圖2。

圖2 血漿miR-650與UC預后關系的限制性立方樣條圖

3 討論

腸上皮細胞在機體免疫防御方面發揮著重要作用，可阻止外源性物質進入機體。有研究報道，miR-650在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[16]。另有研究表明，miR-650可誘發腸上皮細胞凋亡，促使UC發病及進展[12]。由此推測，miR-650表達水平可能與UC的預后有關。本研究結果顯示，治療后預后良好組和預后不良組血漿miR-650表達水平均較治療前降低，且預后良好組血漿miR-650表達水平低于預后不良組，提示miR-650參與了UC的進展過程，檢測其水平或可評估UC預后。

本研究采用結直腸鏡檢查了解UC患者的預后情況，結果顯示UC患者的預后不良發生率為37.61%，與劉會永等[17]的研究結果相近。本研究構建了miR-650診斷UC預后的ROC曲線，結果顯示治療后miR-650評估UC預后的AUC、敏感度和特異度分別為0.865、88.64%和82.19%，其效能高于治療前miR-650，提示治療后miR-650對于UC預后評估具有較高價值，可輔助指導臨床醫師制定UC治療方案及評估預后。

既往研究結果顯示，UCEIS評分和激素療法是UC預后的危險因素[18-20]。本研究采用Logistic回歸模型分析影響UC患者預后的相關因素，結果顯示UCEIS評分、初始治療方案是UC預后的獨立危險因素，與上述研究結果一致。本研究結果還顯示血漿miR-650亦是UC預后的獨立危險因素。此外，限制性立方樣條擬合Logistic回歸分析結果顯示血漿miR-650表達水平與UC預后有關，與miR-650=0.58時比較，當miR-650<0.58時，患者發生預后不良的風險降低；當miR-650>0.58時，患者發生預后不良的風險升高。上述結果均表明血漿miR-650與UC患者預后有關，推測其原因為miR-650可調控UC患者腸上皮細胞凋亡，檢測其表達水平有助于了解細胞凋亡情況，進而可反映患者的預后情況。

綜上所述，血漿miR-650表達水平與UC患者的預后密切相關。治療后血漿miR-650表達水平越高，提示UC患者預后不良的風險越高。檢測UC患者血漿miR-650表達水平有助于評估患者預后。本研究仍存在一定不足，如納入研究的樣本量偏小，且為單中心研究，導致結果可能存在偏倚，下一步將開展大樣本、多中心研究。此外，本研究僅檢測了治療2周后的miR-650表達水平，尚不能確定其是評估預后的最佳時點，下一步將增加檢測時點，以彌補本研究的不足。