胃癌患者血清miR-515-3p水平與臨床病理特征及預后的關系

吳維宇 汪 力 張雪蓮 黎 軍

原發性胃癌是中國消化道常見腫瘤，由于人口老齡化等原因，原發性胃癌的發病率呈逐年升高趨勢，對符合適應證的患者及時行手術治療是延長生存時間的有效方式[1-2]。隨著原發性胃癌患者手術治療的增加，有研究發現病情相似患者的遠期生存結局存在較大差異[3-4]，推測存在某些影響預后的重要因素。Han等[5]的研究顯示miR-515-3p可能是參與胃癌發生的潛在生物學標志物。本研究探討了血清miR-515-3p與原發性胃癌患者病情及手術后生存結局的內在聯系，旨在為原發性胃癌患者的預后預測、治療方案個體化等提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月至2015年1月在成都醫學院第一附屬醫院接受胃癌手術治療的130例原發性胃癌患者作為原發性胃癌組，其中男性67例、女性63例，年齡41～78歲，平均年齡為(56.84±9.17)歲，術前體質量指數(BMI)20～26 kg/m2，平均BMI為(23.03±2.87)kg/m2。納入標準：(1)手術切除標本經病理檢查證實為原發性胃癌，為首次確診并接受手術治療；(2)術前未曾接受新輔助化學治療；(3)能遵照醫囑接受系統治療、臨床資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他原發性惡性腫瘤；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)合并嚴重傳染性疾病、乙醇和藥物濫用、精神病史等可能影響治療過程及治療結局的其他疾病。病例脫落標準：(1)未按照預定方案完成治療；(2)拒絕隨訪或隨訪期間失聯；(3)隨訪期間因其他原因導致死亡。130例患者均完成隨訪。另選擇同期在本院進行體檢的100名健康志愿者作為正常對照組，其中男性51例，女性49例，年齡39～77歲，平均年齡為(56.17±10.85)歲，BMI 21～26，平均BMI為(23.18±2.39)kg/m2。原發性胃癌組與正常對照組的性別、年齡、BMI等基礎資料差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 血清miR-515-3p水平測定

原發性胃癌組和正常對照組均于入組時即抽取空腹外周靜脈血5 mL，2 000 r/min離心10 min，留取上層血清標本，凍存于-80 ℃冰箱中備用。miR-515-3p水平的具體測定步驟是：加入TRIzol提取總RNA，采用Bio-Rad680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定其濃度和純度，使用反轉錄試劑盒(日本TOYOBO公司)將總RNA反轉錄為cDNA。以U6作為內參進行標準化定量，引物序列見表1。使用定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒進行基因擴增，反應條件是95 ℃ 10 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共42個循環。每個樣品設3個復孔，以2-△△Ct計算miR-515-3p基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 臨床病理特征評價

納入性別、年齡、腫瘤最大直徑、Lauren′s分型、TNM分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移這8項臨床病理特征進行比較。

1.4 隨訪及終點事件明確

對于原發性胃癌組患者，術后采用電話、門診復診等形式進行長期隨訪，以2020年1月1日或該時間點前患者死亡作為隨訪終點。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料的兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料的兩組間比較采用卡方檢驗，不同血清miR-515-3p水平胃癌患者的預后比較采用Kaplan-Meier生存曲線，血清miR-515-3p水平對胃癌患者預后的預測價值分析采用受試者工作特征(ROC)曲線，原發性胃癌患者預后的影響因素采用Cox比例風險模型分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的血清miR-515-3p水平比較

原發性胃癌組和正常對照組的血清miR-515-3p水平分別為0.66±0.11、0.46±0.09，前者顯著高于后者，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 原發性胃癌患者血清miR-515-3p水平與臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、腫瘤最大直徑、Lauren′s分型的原發性胃癌患者的血清miR-515-3p水平的差異無統計學意義(P>0.05)。不同TNM分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移的原發性胃癌患者的血清miR-515-3p水平差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 原發性胃癌患者血清miR-515-3p水平與臨床病理特征的關系

2.3 血清miR-515-3p水平預測原發性胃癌患者預后的ROC曲線

截至隨訪終點，130例原發性胃癌患者共有56例(43.08%)死亡。經ROC曲線發現，血清miR-515-3p水平預測原發性胃癌患者隨訪期內死亡的最佳截斷值為0.67，ROC曲線下面積(AUC)為0.790(95%CI：0.714～0.865)，對應的敏感度、特異度分別為71.62%、64.29%。見圖1。

圖1 血清miR-515-3p水平預測原發性胃癌患者預后的ROC曲線

2.4 不同血清miR-515-3p水平的原發性胃癌患者的預后比較

以根據ROC曲線約登指數計算出的血清miR-515-3p水平(0.67)為界，將130例原發性胃癌患者分為高表達組(79例)和低表達組(51例)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-515-3p低表達組的預后優于miR-515-3p高表達組(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同血清miR-515-3p水平原發性胃癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 原發性胃癌患者預后影響因素的Cox比例風險模型分析

以血清miR-515-3p水平、TNM分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移作為自變量進行原發性胃癌預后影響因素的Cox比例風險模型分析，結果顯示血清miR-515-3p水平較高、TNM分期較高、分化程度較低、局部浸潤深度較大、合并淋巴結轉移是原發性胃癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 原發性胃癌患者生存預后影響因素的Cox比例風險模型分析

3 討論

原發性胃癌的治療方案主要根據患者的臨床病理特征確定，早期實施手術治療對患者預后改善具有決定性作用。然而，接受相同治療方案的患者的預后存在差異，若能早期篩查患者的治療后死亡風險，并對治療方案進行個體性優化、可能有助于治療后胃癌患者的生存時間延長、病死率降低等。越來越多的證據表明微RNA(miRNA)異常表達在包括胃癌在內的惡性腫瘤發生、發展中發揮了重要作用。李偉等[6]的研究發現，胃癌組織中miR-181高表達、miR-133a低表達，兩者均可能參與了胃癌的發生、發展，且影響了患者的預后。何春華等[7]的研究發現，胃癌患者的血清miR-93-5p水平升高，且與臨床分期、浸潤深度、淋巴結轉移關系密切，在胃癌診斷和預后預測中具有重要價值。miR-515-3p于2019年首次被發現在原發性胃癌患者的癌細胞及血漿中異常高表達，初步提示其可能參與了胃癌的發生、發展，但其對患者預后的影響尚不明確[5]。國內尚未見miR-515-3p相關的臨床研究報道。本研究發現，與正常對照組相比，原發性胃癌組的血清miR-515-3p水平明顯升高，與既往研究結論吻合。進一步分析血清miR-515-3p水平與原發性胃癌患者臨床病理特征的關系，發現TNM分期較高、分化程度較低、局部浸潤深度較大、合并淋巴結轉移的患者的血清miR-515-3p水平較高。TNM分期、分化程度、局部浸潤深度、淋巴結轉移是判斷大多數腫瘤惡性程度的重要指標[8-10]，上述結果再次佐證了血清miR-515-3p高表達對原發性胃癌患者病情的促進作用，其具體作用機制不明，有待后續深入研究。

目前原發性胃癌患者的手術治療預后并不十分理想，部分患者在術后短時間內死亡[11-12]，多數研究認為這是一個多因素作用的結果，但尚缺乏有效手段將高死亡風險患者在術前篩查出來。鑒于血清miR-515-3p水平與原發性胃癌患者病情進展的緊密聯系，推測其可能在患者死亡風險篩查中具有一定的價值。本研究采用ROC曲線進行分析，發現血清miR-515-3p水平預測原發性胃癌患者隨訪期內死亡的最佳截斷值為0.67，AUC為0.790(95%CI：0.714～0.865)，對應的敏感度、特異度分別為71.62%、64.29%。上述結果提示血清miR-515-3p水平在術前預測原發性胃癌患者術后遠期死亡風險方面具有一定價值，有可能成為TNM分期相同患者的病情進一步分級、治療方案個體化的重要參考指標。

本研究對原發性胃癌患者進行長期隨訪并分析死亡結局，發現miR-515-3p低表達組原發性胃癌患者的預后更優。進一步經Cox比例風險模型分析證實，血清miR-515-3p高表達是原發性胃癌患者預后不良的獨立危險因素。上述結果證實血清miR-515-3p表達變化對原發性胃癌患者手術后預后不良存在直接影響，其可能成為胃癌治療的新靶點，這有待更多基礎研究及臨床實踐明確。

綜上所述，原發性胃癌患者血清miR-515-3p水平異常升高，且與臨床病理特征存在緊密聯系，是患者術后遠期死亡的獨立危險因素之一，且術前血清miR-515-3p表達水平對患者遠期死亡風險具有早期預測價值。本研究明確了血清miR-515-3p水平在原發性胃癌患者病情及預后方面扮演的重要角色，但也存在不足之處：(1)納入病例數有限，可能使結果發生偏倚；(2)未涉及靶向干預miR-515-3p對原發性胃癌病情的影響等。后續將完善不足之處，進行深入研究。