小鼠非酒精性脂肪肝纖維化對骨微結構的影響及姜黃素治療作用

王銅浩 唐飛 田永剛 陳志清 鄭金鑫

1.天津市人工細胞工程技術研究中心；天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室；天津市肝膽疾病研究所；天津市第三中心醫院骨科，天津 300170 2.天津市第三中心醫院消化科/肝內科，天津 300170

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是最常見的慢性代謝性肝病之一，是一種廣泛的肝臟損害的病理狀態，范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化。在最近的流行病學研究中發現NAFLD與骨質疏松癥顯著相關[1]。一些研究支持低骨密度(BMD)與NAFLD關系密切[2-3]，而Kaya等[4]發現NAFLD對骨密度有促進作用，并且這種促進作用與血清細胞因子水平無關。因此NAFLD和骨密度之間關系仍然存在爭議。此外，雖然脂肪肝與骨質疏松的研究已經不少，但NAFLD纖維化與骨質疏松相關性研究很少，并且目前臨床上還沒有找到一種藥物能夠有效的改善NAFLD纖維化及其并發癥。本研究應用高脂飲食(HFD)誘導非酒精性脂肪肝(NAFLD)纖維化模型小鼠，并給予姜黃素治療，通過micro-CT分析脛骨近端，探討NAFLD纖維化對骨微結構及骨密度的影響及姜黃素的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡雌性野生型C57BL/6小鼠30只，體重(20±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號[SCXK(京)2016-0006]。實驗動物常規飼養于天津第三中心醫院肝膽研究所清潔級動物房，12 h光照和黑夜循環，溫度21～22 ℃, 相對濕度50 %～60 %，動物自由采食和飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組與處理：小鼠適應1周后，隨機平均分為3組：對照組(WT組)；高脂飲食組(HFD組) 和姜黃素治療組(HFD+Cur組)。正常對照組給予普通飼料飼喂，高脂飲食組給予高脂飲食飼養(60 %的能量來自脂肪)建立NAFLD小鼠模型，姜黃素治療組除了給予高脂飲食外，在24周時同時給予姜黃素治療(以重量的3 %加入高脂飲食，純度>96 %，購于Sigma公司)，有研究表明這一濃度的姜黃素可以逆轉與NAFLD相關的代謝紊亂[5]。飼養方式均為自由飲食，飲水。

1.2.2取材及標本制備：第32周末，結束實驗，喂養期間HFD組有1只小鼠死亡，剩余大鼠稱體重并記錄，禁食12 h后均用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，斷頭處死，所有小鼠收集血樣，靜置15～20 min，離心分離血清(4 000 r/min, 10 min)。將血清在-20 ℃保存，同時分離兩側脛骨，剝離附著的肌肉組織后，在4°C磷酸鹽緩沖的福爾馬林(PBF，pH 7.4)中保存24 h，然后每個樣本與70 %乙醇脫水48 h，縱向放置在充滿70 %乙醇的試管中，直到使用。

1.2.3血清生化檢測：應用日立全自動生化分析儀(日本)檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、三酰甘油(TG) 和膽固醇(TC) 水平，應用Quick EIATM小鼠TNF-α ELISA試劑盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Dakewe biotech Company Limited)檢測各小鼠血清中的細胞因子TNF-α和IL-6表達水平，分別使用放射免疫分析試劑盒(ALPCO, Windham, NH)和ELISA試劑盒(Insight Genomics, Falls Church, VA)測定血清胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)和胰島素樣生長因子結合蛋白-1 (IGFBP-1)的水平。

1.2.4肝組織病理學檢測：切除小鼠肝臟同一部位，置于4 %多聚甲醛(PFA) 中固定24 h，然后脫水12 h，蠟包埋、切片，用二甲苯透明，梯度乙醇脫水，HE染色后進行光鏡病理學檢測。

1.2.5Micro-CT掃描：將樣本放入含有70 %乙醇的圓柱形塑料管中，密封塑料管，放入micro-CT(Skyscan 1076 micro-CT system；skyscan，Aartselaar，Belgium)中進行脛骨近端掃描，掃描過程360 °旋轉，電壓50 kV，電流200 μA，曝光時間2 000 ms/幀，分辨率9.0 μm×9.0 μm×9.0 μm，將樣本周圍的增量角設置為0.5 °，自脛骨干骺端1.5 mm處向下掃描300個片段，該區骨小梁數目較為豐富，將獲得的掃描圖像導入醫學影像三維重建軟件Mimics 17.0軟件(Materialise Company, Leuven, Belgium)。對骨密度(BMD)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨體積比(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、連接密度(connectivity density，Conn.D)，皮質厚度(cortical thickness，C.Th)進行形態學測量和分析。其中測定的骨密度包括骨小梁容積密度(trabecular volumetric BMD，vBMD)，代表骨小梁器官水平上的骨密度，和組織骨密度(tissue BMD，tBMD)，代表骨小梁組織水平上的骨密度

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 體重變化及血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平

與WT組相比，HFD組血清中AST明顯升高(P<0.05)，而體重、TC、ALT升高更加明顯(P<0.01)；與HFD組相比，姜黃素治療后小鼠體重以及血清中AST、TC、ALT水平明顯下降(P<0.05)，更接近于WT組(P>0.05)；但3組小鼠血清中TG的水平變化不明顯，差異無統計學意義。見表1。

表 1 小鼠體重及血清ALT、AST、TG 和TC 水平Table 1 Body weight and serum levels of ALT, AST, TG and TC in mice

2.2 血清炎性細胞因子，IGF-1及IGFBP-1水平

與WT組相比，HFD組小鼠血清中炎性細胞因子IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而IGF-1和IGFBP-1水平變化更加明顯(P<0.01)；經姜黃素治療后，IL-6、TNF-α、IGFBP-1水平明顯下降(P<0.05)，IGF-1水平明顯升高(P<0.05)，各指標均接近WT組(P>0.05)。見表2。

表 2 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IGF-1、IGFBP-1水平

2.3 各組小鼠脛骨近端骨微結構及骨密度參數

HFD組小鼠脛骨近端參數BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、Conn.D、C.Th、vBMD、tBMD及骨干形態與WT組相比差異具有統計學意義(P<0.05、P<0.01)，見表3，圖1 E，姜黃素治療后各小鼠骨微結構及骨密度參數及骨干形態較HFD組明顯好轉(P<0.05、P<0.01，圖1F)，部分參數接近WT組(P>0.05)。

表 3 各組小鼠骨微結構及骨密度參數變化Table 3 Changes of bone microstructure and bone density parameters in each group of mice

2.4 肝臟的組織病理學改變及脛骨近端骨形態變化

WT組小鼠肝組織細胞大小、結構、形態正常，肝小葉規則(圖1 A)。HFD組小鼠肝細胞腫脹明顯，體積明顯增大，出現明顯脂肪變性，細胞質內可見大小不等的脂肪空泡，并伴有炎癥細胞的浸潤和灶狀肝細胞壞死，以及匯管區組織纖維化增生(圖1 B)。HFD+Cur 組小鼠肝細胞體積明顯小于HFD組，脂肪變性及炎性程度明顯輕于HFD組，未見明顯壞死灶及纖維化(圖1 C)

應用Micro-CT掃描各組小鼠脛骨近端，經過三維重建后可清晰的顯示骨形態變化，通過進行圖像之間的比較分析，我們可以更加直觀、形象地發現HFD組小鼠(圖1 E)與WT組小鼠(圖1 D)相比脛骨近端骨小梁數目減少、骨小梁間隙增寬、皮質厚度變薄，而經過姜黃素治療后各指標出現明顯好轉(圖1 F)。

注：A，D：WT組；B，E：HFD；C，F：HFD+cur。黑色箭頭所示炎細胞浸潤；紅色箭頭顯示骨小梁，骨皮質變化。圖1 各組小鼠肝臟組織病理學變化及脛骨近端骨微結構變化(200×)Fig.1 Histopathological changes of liver and bone microstructure changes of proximal tibia of mice in each group(200×)

3 討論

近些年來，人們對NAFLD與骨質疏松的聯系進行了臨床以及流行病學研究，然而，迄今為止所得到的一些證據存在相互間矛盾[6]。而NAFLD纖維化與骨密度的關系及發病機制更鮮有研究。在C57BL/6小鼠中，通過60 %的脂肪能量誘導NAFLD發生的代謝改變與人類代謝綜合征相似，包括血脂異常、炎癥和肥胖[7]。Li等[8]發現小鼠NAFLD模型在24周時肝臟出現纖維化，32周時纖維化更加明顯。故本研究在24周時給予姜黃素治療，32周末行肝臟病理及骨組織Micro-CT檢測，探討HFD誘導的NAFLD纖維化小鼠模型的骨微結構，骨密度變化及發病機制，同時研究了姜黃素的治療效果。

由于復雜多因素機制，肝纖維化與低骨量相關病理生理學尚不清楚。我們發現HFD組小鼠在32周時體重、AST、TC、ALT明顯升高，病理出現明顯纖維化，炎性因子IL-6、TNF-α明顯升高，同時伴有骨微結構及骨密度變化，出現明顯骨質疏松。細胞炎性因子作為肝纖維化，肝硬化的介質，在NAFLD疾病發展過程中起到至關重要的作用[9]。而IL-6與TNF-α作為最重要的炎性因子在NAFLD肝纖維化患者中明顯升高，并且與肝纖維化程度正相關[10]。同時慢性炎癥也是骨質疏松癥的危險因素之一，因為炎性細胞因子的激活可導致骨質流失[11]。IL-6是骨吸收明顯的促進劑，促進破骨細胞前體的分化，增加破骨細胞活性，促進骨吸收[12]，而血清TNF-α水平升高則直接刺激破骨細胞的成熟與活化，并刺激成熟的破骨細胞分泌IL-6[13]，二者共同促進破骨細胞形成，使骨吸收增加，導致骨質疏松發生。因此，將NAFLD纖維化與骨質疏松癥聯系起來的一個重要原因是慢性炎癥的出現。

相對于炎性因子的變化，我們發現IGF-1、IGFBP-1變化更加明顯。與WT組相比，HFD組IGF-1出現明顯下降，IGFBP-1出現明顯升高。有研究發現與健康對照組相比，NAFLD患者的IGF-1水平較低，并且IGF-1水平與NAFLD的組織學嚴重程度呈負相關[14],而IGF-1是骨細胞功能最重要的調節因子之一，因為它對骨骼具有合成代謝作用[15]。在6個月和19個月大的小鼠中，肝臟來源的IGF-1被證明是正常皮質骨量所必需的，IGF-1的缺乏導致了骨皮質孔隙率的增加[16]。另外研究表明，血清IGFBP-1和IGF-I水平與NAFLD患者的晚期纖維化之間存在相關性[17]。IGFBP-1主要在肝臟中產生，是6種可特異性結合IGF-1并調節其功能和生物利用度的可溶性結合蛋白之一，循環中的IGFBP-1具有跨越毛細血管屏障的能力，對細胞水平產生直接影響[18]，這意味著血清IGFBP-1高水平能夠反映骨組織中高水平的IGFBP-1[19]。據報道，IGFBP-1越高的女性肌肉質量越低[20]。最近的一項前瞻性研究(10年隨訪)發現老年女性血清IGFBP-1和骨質疏松性骨折之間的呈正相關，并且IGFBP-1對骨組織的作用獨立于IGF-1[21]。這表明IGFBP-1可能在骨代謝有重要作用，并可能保持成年小鼠的骨小梁。因此，我們推測IGF-I和IGFBP-1對NAFLD纖維化期骨組織和BMD的變化起到更加重要的作用。

姜黃素是從姜黃根部提煉的最主要的色素成分，是一種歷史悠久并用于治療多種疾病的草本藥物[22]。在HFD誘導的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黃素能夠改善胰島素抵抗和肝脂肪變性[23]，并且姜黃素可顯著降低HFD小鼠的脂質過氧化和活性氧對細胞的損傷，有望成為預防NAFLD的有效手段[24]。在我們研究中同樣也發現了姜黃素降低HFD組小鼠血清中ALT、TG和TC水平，減少脂肪聚集。此外，補充姜黃素也有助于預防和治療骨質疏松[25]。然而，迄今為止，還沒有關于姜黃素對NAFLD骨微結構或BMD影響的臨床或動物研究。

姜黃素是一種高度多效性的分子，能夠與炎癥相關的許多分子靶點相互作用。在APP/PS1轉基因小鼠中，姜黃素通過降低小鼠體內炎性因子TNF-α、IL-6的水平，從而改善骨微結構，增加骨密度[26]。在HFD誘導的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黃素可抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達，從而減輕肝臟炎癥[27]，而這些細胞因子與骨質疏松癥密切相關，因此姜黃素可通過降低炎性因子改善骨質量。同時研究發現姜黃素對IGF-1信號通路具有調節作用[28]。在糖尿病大鼠中，姜黃素通過上調IGF-1基因降低血糖，改善糖尿病誘導的氧化應激[29]。而對于IGFBP，只有Chang等[30]研究發現姜黃素通過誘導口腔癌細胞中IGFBP-5啟動子活性來上調IGFBP-5。除此之外，沒有發現其他關于姜黃素與IGFBP關系的研究。本研究首次闡明了姜黃素對IGFBP-1的調節作用。因此，我們認為姜黃素在NAFLD纖維化期可能通過調節血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1水平，從而改善骨微結構，增加了皮質厚度及骨密度。

上述研究提示小鼠非酒精性脂肪肝纖維化期可出現明顯骨質疏松，血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1變化在發病機制中起到重要的作用，其中IGF-1和IGFBP-1作用尤為重要，而姜黃素調節這些細胞因子可減輕脂質聚集，增加骨小梁，骨皮質及骨密度。由此可見，姜黃素可能是NAFLD纖維化期骨質疏松潛在的治療手段。然而NAFLD病理機制復雜，仍有許多問題需要闡明，更好地理解骨代謝和肝臟之間的聯系，可能會為治療NAFLD和骨質疏松這兩種非常普遍的疾病開辟一個新的領域。