基于網絡藥理學和分子對接探討補腎活血湯“從虛從瘀”治療骨質疏松癥的分子機制

岳志軍 姜自偉 李紫閣 李紹爍 阮冠龍 王睿 趙京濤*

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405 2.南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071

骨質疏松癥是臨床上的常見病，其特點以骨量降低、骨組織結構異常、導致骨脆性增加、繼發(fā)骨折的危險性增加為特征的骨骼疾病[1]。由于人口老齡化, 骨質疏松癥以及其導致的骨折發(fā)病率居高不下。西醫(yī)治療OP的藥物常包括骨吸收抑制劑、骨形成促進劑、骨礦化藥物以及新近報道的藥物等[2]。但是西藥治療OP仍然有很多缺陷，常會出現服藥后不良反應，不少抗OP藥會導致患者不耐受，此外還有一些藥物對于治療OP的療效不確切[3]。近年來，隨著中醫(yī)藥自身的不斷發(fā)展，保持自身內涵的同時結合現代科技，中醫(yī)對骨質疏松癥的研究日益增多，中醫(yī)藥理論治療OP有效性的研究不斷被挖掘，凸顯中醫(yī)治療OP的優(yōu)勢，并取得了一定的成果[4]。

中醫(yī)理論中無骨質疏松的病名，按照其癥狀及相關臨床特點可以將其歸納于“骨痿”、“虛勞”、“骨痹”等范疇[5]。肝腎虧虛，筋脈不利是骨痿的基本病機[6]。肝腎不足會導致氣滯血瘀，并且氣滯血瘀也會導致肝腎虧虛，因此老年骨質疏松癥患者通常具有肝腎不足兼氣滯血瘀的特征。“補腎強筋，活血化瘀”是中醫(yī)藥治療骨痿病癥的重要原則，目前多數實驗及臨床研究已經證實[7-9]，補腎活血湯在促進骨折愈合、提高骨密度及改善骨代謝水平等方面療效顯著，但其內在成分眾多，分子間作用關系十分復雜，致使其微觀作用機制缺乏全面、系統(tǒng)的闡述，需要進一步探討。

本研究將《傷科大全》里面的經典名方補腎活血湯[10-12]進行網絡藥理學和分子對接，挖掘補腎活血湯抗骨質疏松的關鍵靶點和通路，探索關鍵化合物與關鍵靶點的分子對接，揭示補腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內在分子機理，為臨床抗骨質疏松發(fā)揮中醫(yī)藥特色提供科學指導方案。

1 材料和方法

1.1 補腎活血湯化合物及靶點預測

通過TCMSP數據庫分別對補腎活血湯中的中藥“熟地”、“菟絲子”、“杜仲”、“枸杞”、“山萸肉”、“肉蓯蓉”以及“當歸”、“紅花”、沒藥、“獨活”進行檢索，按ADME原則(口服利用度≥30 %，類藥性≥0.18)[13-14]進行篩選，獲得其化合物，并預測其對應靶點；根據Uniprot數據庫，進行基因注釋，規(guī)范對應靶點信息。對未檢索到的中藥“補骨脂”，分別從BATM-TCM數據庫、化學數據庫、TCMID數據庫以及知網中查詢相關化合物，然后通過PubChem數據庫獲取化合物的2D結構，導入Swiss ADME得到其SMILES，同樣根據ADME原則進行篩選，對篩選出的化合物通過Swiss Target Prediction數據庫進行預測，獲取其對應靶點。

1.2 骨質疏松癥的疾病靶點收集

以“osteoporosis”為關鍵詞，分別從Gene Cards、OMIM數據庫搜索相關的作用靶點，對收集到的疾病靶點進行整合、去重，預測出疾病相關靶點，獲取相應的基因標準名。利用韋恩圖在線制作網站Draw Venn Diagram，獲取藥物與靶點交集基因數目，繪制出韋恩圖。

1.3 構建“中藥-化合物-靶點-疾病”可視化網絡

將中藥、活性成分、靶點、疾病相關數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，使用“Network Analyzer”功能獲得其拓撲學參數，構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡，然后根據“Degree”值篩選出核心化合物。

1.4 蛋白互作網絡(PPI)的構建

將1.3中獲得的交集基因導入蛋白互作平臺String數據庫，導出其蛋白間相互作用數據至Cytoscape 3.7.2進行網絡可視化分析，獲得蛋白互作網絡的拓撲學參數。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析

使用 R 軟件及其后臺數據庫“org.Hs.eg.db”獲取潛在作用靶點的基因 ID；再利用“DOSE”、“cluster Profiler”、“path view”程序包對這些潛在作用靶點進行 GO和KEGG富集分析；GO 功能富集分析包括三個方面的內容：生物學過程富集分析(biological process, BP)、細胞組成富集分析(cellular component, CC)、分子功能富集分析(molecular function, MF)，設定 p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05；將每一類按照顯著性進行排序，把排在GO 功能富集分析前10和KEGG富集分析前30的富集條目通過柱狀圖和氣泡圖的形式進行可視化展示。

1.6 分子對接

為進一步明確補腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內在分子機制，將1.3和1.4中篩選出的核心化合物和關鍵靶點進行分子對接。通過pubchem網站檢索獲取核心化合物的3D結構，下載SDF文件并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉化為PDB文件，從 Protein Data Bank數據庫中檢索獲得受體，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體進行去水、去配體等操作，采用Autodock 4.2.6軟件對受體進行加氫以及計算電荷處理，設置受體對接格點參數將小分子配體可能結合的活性口袋位點進行包含，并將受體和配體分別轉化為pdbqt格式，利用Auto Dock Vina 1.1.2對受體與配體分別進行分子對接，對接后獲取其構象。

2 結果

2.1 補腎活血湯活性成分篩選和對應靶點預測

在TCMSP數據庫中共篩選出162種化合物，并預測出2 568個活性靶點，經整理去重獲得146個對應靶點；補骨脂的化學成分共148個，得到9種活性化合物，預測出56個活性靶點，整理去重獲得29個對應靶點。最終補腎活血湯共獲得171種化合物，其中當歸2個、熟地2個、獨活9個、杜仲24個、枸杞40個、紅花17個、沒藥43個、肉蓯蓉6個、山茱萸17個、菟絲子10個、補骨脂9個，中藥之間共有成分有11個，分別為beta-sitosterol、quercetin、stigmasterol、kaempferol、CLR、yangambin、beta-carotene、Mandenol、Ethyl linolenate、poriferast-5-en-3beta-ol、sitosterol。將補骨脂與其余10種中藥的對應的靶點合并去除重復，共收集到166種活性靶點。

2.2 疾病靶點的搜集

通過Gene Cards、OMIM數據庫檢索到與“osteoporosis”相關靶標1 335個。將補腎活血湯與OP中的靶標取交集共獲得54個交集基因，見圖1。分別為PON1、JUN、NOS2、ESR1、AR、PPARG、PTGS2、CA2、PGR、SLC6A4、ESR2、NR3C1、DPP4、RXRA、NR3C2、TNFSF15、MMP1、SELE、VCAM1、CYP3A4、HMOX1、GSTM1、DRD2、ODC1、MMP2、IL6、MAPK1、CTSD、CCL2、IL1B、MPO、F3、SOD1、TP63、COL1A1、EGF、VEGFA、POR、COL3A1、RB1、IL-2、MMP3、CASP7、MMP13、MMP8、APP、CYCS、G6PD、EHHADH、CYP19A1、AKT1、HTR2A、HTR2C、ESRRA。

圖1 補腎活血湯與OP的交集基因Fig.1 The intersection gene of Bushen Huoxue decoction and osteoporosis

2.3 “中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡分析

通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡，將網絡中各個節(jié)點及邊的數據進行網絡拓撲分析，如圖2，其中紅色代表疾病，藍色代表中藥，綠色代表靶點，紫色代表有效成分。共得到207個節(jié)點，其中包括疾病節(jié)點1個、中藥節(jié)點11個、活性化合物節(jié)點141個、疾病與藥物共有靶點54個和975條邊。其中“Degree”和“Closeness”是對網絡中節(jié)點重要性的描述，兩者值越大，表示該節(jié)點越重要。以“Degree”值的中位數進行篩選，篩選出大于平均數的化合物作為核心化合物。共篩選出11個核心成分，其中前5個分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇。表示以上成分可能為治療OP的重要成分。

圖2 “中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡Fig.2 “Chinese medicine-component-target-disease” visualization network

2.4 補腎活血湯治療骨質疏松癥的作用靶點蛋白互作網絡

利用String數據庫對藥物與疾病共同作用的靶點進行分析，將分析結果導入Cytoscape 3.7.2進行PPI可視化網絡構建，并對蛋白互作靶點前30的關鍵靶點展示，如圖3～圖4。其中節(jié)點表示蛋白質，邊表示蛋白質之間的結合的關系。“Degree”值越大，表示該蛋白在網絡中的重要性越大，圖形越大，顏色越深；邊越粗，顏色也越深，表示蛋白與蛋白相互作用關系越緊密。利用“Degree”值中位數逐步進行篩選，獲取其核心靶點，共篩選到13個核心靶點蛋白，分別為AKT1、IL6、VEGFA、JUN、EGF、PTGS2、CCL2、MAPK1、IL1B、CYCS、MMP2、ESR1、PPARG。表明補腎活血湯通過多靶點發(fā)揮抗炎、免疫調節(jié)、血管形成等達到抗OP的作用。

圖3 補腎活血湯治療OP的蛋白互作網絡Fig.3 The protein interaction network of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

圖4 PPI網絡中前30關鍵靶點柱狀圖Fig.4 Histogram of the top 30 key targets in the PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R語言統(tǒng)計軟件對富集結果使用柱狀圖和氣泡圖進行展示。GO功能富集分析共得到279個富集結果，其中BP、CC、MF分別有198、35、46個富集結果。對排名前10 的條目進行柱狀圖展示，如圖5。其中BP中涉及最高的是營養(yǎng)水平、類固醇激素、腺體發(fā)育等，CC主要聚集于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等區(qū)域，MF主要集中在類固醇激素受體活性、內肽酶活性、核受體活性等，預測補腎活血湯主要通過以上生物學過程中發(fā)揮抗OP的作用。KEGG通路富集分析共有63個富集結果，并對其中前30條信號通路進行富集展示，其中 AGE-RAGR、TNF、IL17、HIF-1等信號通路可能與抗OP相關，表明補腎活血湯在抗炎、維持細胞內穩(wěn)態(tài)和修復及再生損傷組織等方面發(fā)揮重要作用。如圖6。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

為進一步明確補腎活血湯治療OP的關鍵靶標與活性成分之間的結合效能，本研究選取排名前5的活性化合物與核心靶標進行分子對接，分子對接結合能打分及對接參數如表1所示，結合能越低，說明分子與靶點蛋白結合越穩(wěn)定，分別取stigmasterol和MAPK1、stigmasterol和PPARG、beta-sitosterol和PPARG對接構象進行作圖分析，如圖7。表明補腎活血湯中的β-谷甾醇、豆甾醇主要與MAPK1和PPARG具有良好的結合力，能夠充分發(fā)揮抗OP的作用。

表1 關鍵化合物與關鍵靶點分子對接結合能打分及對接參數Table 1 Docking and binding energy scores and docking parameters of key compounds and key target molecules

圖7 補腎活血湯核心化合物治療OP的3個核心靶點的對接結果Fig.7 Docking results of the three core targets of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

3 討論

補腎活血湯具有補腎壯筋，活血止痛之功效，主治肝腎虧損，筋骨失養(yǎng)之骨痿。方中熟地、杜仲、菟絲子、補骨脂、枸杞子、山茱萸、肉蓯蓉補益肝腎，填補精血，強壯筋骨；配以歸尾、紅花、獨活、沒藥活血化瘀止痛，疏通筋脈，全方滋補腎精之中兼有化瘀之力。

本研究利用網絡藥理學和分子對接，探討補腎活血湯治療OP的分子機制。根據“中藥-成分-靶點-疾病”網絡顯示的11個核心成分，大多具有抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化等作用。β-谷甾醇和豆甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫調節(jié)、抗腫瘤等方面表現出良好的藥理作用[15-16]。槲皮素和山奈酚具有多種生物學活性，它具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖等作用[17-18]。

通過構建蛋白互作網絡，共顯示13種治療OP的核心靶點，其中VEGFA對于OP的發(fā)生起著重要作用，其作用于內皮細胞，能夠增加毛細血管的通透性，促進局部血管的生成[19]。此外，VEGFA還能通過調控骨髓間充質干細胞發(fā)揮抗OP的作用。研究表明，VEGFA能夠促進BMSCs的增殖和分化，同時還增加骨鈣蛋白(BGP)和新生血管的數量[20]，預測VEGFA在骨骼血管化過程中與抗OP有關。而且在OP老鼠模型當中，補腎活血中藥能夠顯著提高mRNA表達量，還能夠顯著提高VEGF蛋白表達水平，對腎虛血瘀骨代謝失常而導致的骨質疏松能夠發(fā)揮抗OP的作用[21]。這可能與補腎活血湯“從虛”治療骨質疏松關系密切，客觀上達到“補腎壯骨”的目的。IL-6可以作用于成骨細胞，促使其分泌作用于機體，參與機體病理性骨量丟失的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現，隨著年齡的增長，骨質疏松的情況越突出，IL-6的水平也相應的增加[22]，表明IL-6與骨質疏松的嚴重程度呈正相關。動物性研究也表明，去卵巢大鼠表現為IL-6水平與大鼠腰椎、關節(jié)骨密度均呈明顯負相關[23]。由此推論，補腎活血湯中活性成分通過調控IL-6發(fā)揮抗炎作用來改善骨質疏松的發(fā)生發(fā)展過程。

GO和KEGG結果顯示，補腎活血湯通過多種生物學過程以及多信號通路參與治療OP的過程。晚期糖基化終產物受體(RAGE)，是一種多配體受體，能夠與多種配體相結合RAGE存在于許多類型細胞中，其參與了炎癥消退、細胞內穩(wěn)態(tài)的維持和損傷后的修復及再生等過程[24]。在骨質疏松過程中，RAGE的數量會明顯上調，此外其還參與調節(jié)骨代謝過程[25]。研究發(fā)現，AGEs與sRAGE水平的升高與老年男性髖部骨折發(fā)生率的增加有關，并與骨質減少和骨質疏松的發(fā)生顯著相關[26]。在成骨細胞中，AGE和RAGE的組合可激活Raf/MEK/ERK信號傳導途徑，降低成骨細胞活性并導致veslin-1和LC3B介導的自噬激活[27]。可以推測出補腎活血湯“從瘀”治療骨質疏松與調節(jié)AGE-RAGE通路的關系密切。

根據成分靶點網絡篩選出的核心成分與蛋白互作網絡篩選出的靶點進行分子對接，stigmasterol和MAPK1、PPARG，beta-sitosterol和PPARG之間結合能分數最低，容易結合成穩(wěn)定的構象。這表明這些成分與OP的治療具有重要作用，可將這些成分用于探索治療OP作為研究方向。本研究主要通過網絡藥理學和分子對接來闡述補腎活血湯抗OP的內在機制，未進行實驗驗證研究，需要進一步從實驗角度探索本研究結果。

本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，闡述補腎活血湯“從虛從瘀”治療骨質疏松的活性成分、關鍵靶點和相互作用機制。補腎活血湯對骨質疏松的治療體現了多靶點、多成分、多通路的作用特點，為闡述中醫(yī)藥理論提供了科學的解釋，為進一步探討補腎活血湯治療OP奠定了基礎。