基于WNT16預防骨質疏松非椎體骨折的研究進展

陳天鵬 何才劍 房謀昊 周航 唐彬彬 劉康 梁博程 毛應德龍 郄鳳卿 史曉林*

1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江 杭州 310000 2.浙江省新華醫院，浙江 杭州 310000 3.東京癒心健康研究所，日本 東京

骨質疏松患者由于其骨量減少，骨微結構破壞，骨脆性增加而導致骨折風險大大升高[1]。在50歲以后的骨質疏松患者中，每過10年骨折的概率就增加1倍[2]。骨質疏松骨折主要發生于髖部、椎體、橈骨遠端、肱骨[3]。目前，關于骨質疏松椎體骨折的研究取得了重大進展，而非椎體骨折的研究進展相對落后[4]。但就骨質疏松患者骨折的發病概率、死亡率，和給患者造成的經濟損失和痛苦而言，非椎體骨折遠遠高于椎體骨折，其中尤其是髖部骨折更為顯著[5]。現在臨床上使用的抗骨質疏松藥物，對非椎體骨折風險的預防作用也往往弱于椎體骨折[6]。椎體骨折主要是因為松質骨含量減少，而非椎體骨折主要原因以皮質骨變薄或變脆引起的[7]。基于這些差異，我們推測，抗骨質疏松藥物在皮質骨和松質骨作用可能不一致。皮質骨和松質骨在調節骨穩態所涉及的信號通路可能有所差別。關于Pyle綜合癥的研究證實了這種猜測，在Pyle綜合癥患者中，干骺端骨小梁均勻但骨干部皮質骨明顯減少[8]。

1 WNT信號通路對骨質疏松的影響

WNT信號通路在骨穩態調節中起著至關重要的作用[9]。在經典WNT信號通路中，WNT配體通過激活β-catenin信號，誘導轉錄因子osterix的表達，從而促進骨形成。與此同時，該信號增加了骨保護素(OPG)的形成，抑制骨吸收[10]。在非經典WNT信號通路中，WNT5a通過鈣-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II-TGF-β激活的激酶1-Nemo樣激酶信號轉導抑制了共阻遏物復合物的Ppar-γ反式激活，并誘導了Runx2的表達，從而促進了成骨細胞生成[11]。最近一項研究中發現了一種獨立于β-catenin信號的另一非經典WNT信號通路 ——WNT16。WNT16是家族中的一員，主要表達在皮質骨和骨膜中[12]。研究發現，成骨細胞分泌的WNT16能直接作用于破骨細胞的RANK受體，干擾RANKL與RANK受體的結合而抑制破骨細胞分化。另一方面，WNT16通過促進成骨細胞骨保護素的生成，競爭性抑制RANKL與RANK受體的結合而抑制皮質骨上的骨吸收[13]。

注：WNT16可抑制破骨細胞Rank受體表達及干擾Rank受體與Rankl的結合，抑制破骨細胞分化成熟。WNT16還能通過OPG的表達間接的抑制破骨細胞分化。圖1 WNT信號通路對骨質疏松的影響Fig.1 The influence of Wnt signaling pathway on osteoporosis

2 WNT16增加皮質骨強度

皮質骨的脆性增加是造成骨質疏松性非椎骨骨折的主要因素，但對皮質厚度與密度的調控機制知之甚少[14]。在Ohlsson等[15]對WNT16失活小鼠模型的研究中表明，WNT16失活小鼠對比對照組小鼠，骨皮質厚度明顯下降(P>0.05)。皮質骨厚度減少是由骨吸收增加和骨膜減少形成所致。這表明，WNT16是在骨皮質生長發育中的關鍵調節因子，是皮質骨厚度和非椎體骨折的主要決定因素。因此，WNT16可能成為預防骨質疏松非椎體骨折的關鍵靶點。針對WNT16這一預防骨質疏松非椎體骨折的潛在靶點，通過他莫昔芬誘導小鼠WNT16高表達的實驗中進一步驗證了WNT16在骨穩態中所起的作用。他們發現，在他莫昔芬誘導WNT16高表達的小鼠中，骨膜形成增加，骨皮質明顯增厚，但骨小梁的數量并不增加[16]。這表明，他莫昔芬調節的WNT16可能主要發生在皮質骨。在此項實驗中還發現，在小鼠的股骨皮質骨中WNT16mRNA表達水平明顯升高。這一發現，更加證實了WNT16調控骨量的場所在骨皮質。在這一項研究[16]中也解釋了這一現象，研究者整體上刪除了WNT16基因，小鼠的皮質非常薄，而長骨和椎骨中的小梁卻正常。WNT16在旁作用于皮質骨中的破骨細胞祖細胞，并對破骨細胞的形成產生負調節作用，從而導致皮質骨而不是小梁骨增加。因此，我們可以推測，WNT16作用于骨皮質，在預防骨皮質丟失中有積極作用，可能成為預防骨質疏松非椎體骨折的靶點及藥物開發提供研究方向。

3 WNT16對糖皮質激素性骨質疏松(GIOP)小鼠骨皮質影響

糖皮質激素(GC)由于其良好的抗炎、免疫抑制作用，廣泛地應用于臨床，與此同時，由糖皮質激素引起的骨質疏松及骨折風險也大大增加[17]。GC降低皮質骨含量和厚度，是骨質疏松非椎體骨折的危險因素之一。在先前的研究中發現，GC通過減少各種信號成分，如 β-catenin蛋白來抑制經典WNT信號通路。另外，GC還能促進WNT抑制劑的產生從而抑制WNT信號[18]。這表明，GC誘導的骨質疏松與WNT信號通路密切相關。WNT16作為WNT家族中的一員，與皮質骨骨量與非椎體骨折密切相關[19]。因此，我們推測GC同樣能抑制WNT16而導致骨皮質骨減少和骨折風險增加。Hildebrandt 等[20]在使用潑尼松龍對成骨細胞作用中發現，潑尼松龍明顯抑制了WNT16在成骨細胞中的表達。為測試WNT16能否逆轉成骨細胞功能，在接下來的實驗中，他們往潑尼松龍成骨細胞組中加入了重組WNT16，最后測試成骨細胞骨形成功能得以恢復。這一發現表明WNT16可能是逆轉GIOP的關鍵靶標。但不足的是，本研究僅在細胞層面上表明WNT16能解除GC抑制成骨細胞功能，而在缺乏WNT16在表型上對GIOP的影響。在 Ohlsson等[21]一項研究中彌補了這一不足，他們比較了GC對野生型大鼠和WNT16過表達的轉基因鼠的骨密度發現，WNT16過表達的大鼠BMD顯著高于野生小鼠。這表明WNT16在表型上能拮抗GC導致的骨量流失而預防骨折風險。值得疑惑的是，此項實驗GC降低了野生型WNT16mRNA的表達，但對WNT16過表達的轉基因小鼠WNT16mRNA水平卻沒有影響。在另一項研究中得出了一個與此完全相反的結論，即WNT16的過表達并不能保護GC導致的骨量流失及增加的骨折風險。Alam等[22]研究發現，GC都顯著降低了野生型和WNT16過表達轉基因小鼠的骨密度，骨形成標志物以及WNT16mRNA水平，雖然WNT16過表達轉基因小鼠骨密度，PIN1水平高于野生型，但這種差異可能是由基線水平、組間差異造成的，而且這種差異也不足以完全抵消GC造成的骨量流失和骨折風險。但可以明確的是，WNT16對GC小鼠的骨形成、骨量增加有積極作用，但是否能完全抵抗GC誘導的骨量丟失尚有爭議，值得進一步研究。

4 WNT16對去卵巢大鼠骨皮質影響

絕經后老年女性是骨質疏松癥高發人群，對于她們來說，骨折是毀滅性的打擊[23]。在Mitek等[24]研究了絕經后骨質疏松婦女的基因易感性中發現，在這類人群中，WNT16 rs2908004基因變異的的多態性存在顯著差異。其中，骨折風險大的人群中這一差異更為顯著。因此，我們推測WNT16與絕經后骨質疏松人群的骨折相關。在先前的研究[25]中，已證實雌激素能增加絕經后骨質疏松患者的骨密度和降低其骨折風險。雌激素主要通過抑制破骨細胞分化來增加骨小梁和抑制皮質內骨吸收[25]。但其具體分子機制還不清楚。Almeida等[26]與Sims等[27]兩項對雌激素與WNT16相關性研究中，他們分別使用雌二醇和他莫西芬作用于成骨細胞，實驗結果表明，兩種雌激素類似物干預后WNT16的表達都有所上升。結果似乎表明了雌激素對預防骨折的風險是通過WNT16介導的。在他莫西芬處理WNT16高表達，雌激素受體缺失的小鼠中，骨皮質是雌激素受體缺失野生小鼠的十幾倍，這表明WNT16能彌補雌激素受體缺失導致的骨量流失。這似乎更加支持了雌激素對WNT16的直接調節。但在Movérare-Skrtic等[28]的研究中卻表明雌激素和WNT16的保骨作用是獨立的。WNT16高表達的轉基因小鼠在摘除卵巢后，骨密度降低至與卵巢摘除的野生型小鼠一致。而且，在雌激素干預WNT16缺失的轉基因小鼠的實驗中，仍然能提高小鼠骨強度。盡管雌激素保骨作用是否與WNT16相關還具有爭議，但是WNT16在卵巢摘除小鼠中，增加骨皮質、預防骨折風險卻是明確的[29]。綜上所述，WNT16可能成為預防絕經后骨質疏松骨折的潛在靶標。

5 年齡和性別對WNT16的影響

眾所周知，年齡和性別是骨質疏松和骨折其中重要的影響因素[30]。在上文中論述了WNT16在GIOP和絕經后骨質疏松患者的骨穩態中起著至關重要的作用，但是缺乏了年齡和性別對WNT16的影響。Shen等[31]在性別和年齡對人骨髓基質細胞WNT基因表達的研究中，僅發現WNT16在性別中存在明顯差異，且男性表達高于女性。而WNT16在不同年齡的大鼠中表達水平卻沒有發現差異。而在Todd 等[29]研究中發現，不管是雌性或雄性鼠，WNT16在骨皮質中的表達隨年齡升高而降低，而在腎臟中表達卻沒有隨年齡而變化。因此，我們推測上述兩項實驗結果的差異可能源于檢測組織的不同。我們知道，WNT16主要表達在皮質骨和骨膜，所以我們傾向于后者得出的結論，即WNT16的表達隨年齡增長而降低。這揭示了為什么老年人骨質疏松患病率高和骨折風險大的又一內在原因。WNT16可能為老年性骨質疏松提供研究方向。

6 總結與展望

WNT16在調控骨皮質厚度與骨小梁密度起著至關重要的作用，由于它主要表達在皮質骨和骨膜，因此，WNT16在預防非椎體骨折的作用可能更加重要。在上述的論述中，WNT16對老年、絕經后、糖皮質激素所造成的骨質疏松和非椎體骨折均有一定作用。因此，WNT16可能成為預防各種類型骨質疏松，以及骨質疏松非椎體骨折的關鍵靶標，從而為骨質疏松非椎體骨折臨床研究，藥物設計提供一個有價值的新方向。近期，關于一種WNT脂肪酶——notum的研究中發現，這種脂肪酶能夠明顯抑制WNT信號通路，從而使骨皮質顯著丟失[32]。在通過對notum抑制的研究中發現，notum抑制能明顯增加骨皮質厚度[33]。因此，notum可能成為預防骨質疏松非椎體骨折的又一潛在標靶。只是，現階段關于notum的基礎研究尚少，notum與降低骨質疏松風險的關聯存疑，值得進一步深入研究。