毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中的工藝優(yōu)化

危夢，劉文龍，鄒強，周衡剛，邵良偉，劉達玉*

1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室（成都 610106）；2.黃埔海關技術中心（廣州 510730）

豆豉的后發(fā)酵過程是形成豆豉獨特風味和各種功能因子的關鍵步驟[1]。豆豉發(fā)酵過程中蛋白質等水解生成的氨基酸、活性肽等物質是其風味的主要來源。豆豉后發(fā)酵工藝過程，對豆豉中有機酸、醇類、酯類、醛類等化合物的形成有較大影響[2]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵的毛霉型豆豉后發(fā)酵時間較長，一般要至少發(fā)酵1年以上，因此其風味往往比快速發(fā)酵的豆豉要好。目前工業(yè)上為了縮短生產周期，采用的是提高后發(fā)酵溫度，通過高溫加速各種生化反應的速度來達到縮短發(fā)酵時間的目的，但是會對風味造成一定影響。在后發(fā)酵過程中，適當?shù)纳郎乜梢允姑阜磻铀伲敎囟冗^高時，因酶的本質是蛋白質，其結構會遭到破壞，反而效果不佳[3]。

試驗以在潼川傳統(tǒng)毛霉型豆豉后發(fā)酵工藝的基礎上，通過適當升溫縮短發(fā)酵時間和添加乳酸菌以及酵母菌來強化后發(fā)酵工藝[4]。乳酸菌生長繁殖后，可以產生有機酸，利于酵母菌的生長繁殖，同時生成的乳酸又能與醇類合成酯及香氣成分的前體物質。酵母菌可利用豆豉中的還原糖進行酒精發(fā)酵，發(fā)酵己糖生成醇類物質，結合豆豉中產生的有機酸還可生成酯類物質，從而賦予豆豉醇的香氣和加速產品后熟[5]。

1 材料與方法

1.1 原輔料與試劑

黃豆，市售。毛霉菌種，由四川省成都大學藥學與生物工程給學院實驗室提供。

成熟豆豉曲：由制曲工藝（菌粉接種量0.21%、制曲溫度17 ℃、發(fā)酵時間6 d、制曲相對濕度86% RH）制得；乳酸菌：此次試驗使用的發(fā)酵乳桿菌是發(fā)酵乳酸菌的異形發(fā)酵、乳糖代謝、半乳糖等多種糖類，生成乳酸、醋酸、琥珀酸、乙醇等代謝產品。魯氏酵母AS2.371：具有耐鹽的特點，能在食鹽含量低于18%的環(huán)境中生長繁殖良好，具有增香的功能；食用鹽：精純鹽；白酒：選用低度白酒；醪糟：選用四川東柳醪糟有限責任公司生產的東柳醪糟。

氫氧化鈉、37%甲醛、硫酸銨、丙三醇、硫酸銅、無水乙酸鈉、硫酸鉀等，均為國產分析純；MRS培養(yǎng)基，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

GNP-9160隔水式智能恒溫培養(yǎng)箱，常州雙瑞儀器制造有限公司；SH-020恒溫恒濕試驗箱，上海上器集團試驗設備有限公司；PHS-2 pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；HSU-80手持鹽度計，上海精密儀器儀表有限公司；KDN-102C凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；JA3103N電子分析天平，上海民橋精密儀器科學有限公司；WXL-30W臺稱，瑞安市浩展衡器有限公司；DL-2萬用電爐，北京中興韋業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗工藝參數(shù)的確定

在潼川傳統(tǒng)毛霉型豆豉后發(fā)酵工藝的基礎上，通過適當升溫縮短發(fā)酵時間和添加乳酸菌和酵母菌來強化發(fā)酵，以氨基態(tài)氮含量和總酸含量為評價指標，研究不同的食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時間等因素對豆豉成品氨基態(tài)氮含量和總酸含量的影響，并在單因素試驗的基礎上進行正交優(yōu)化試驗，以此來確定后發(fā)酵工藝的最佳條件[6]。

根據(jù)單因素試驗的結果分析，設計L9(34)正交試驗，研究食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時間對豆豉質量的影響，以氨態(tài)氮含量和總酸含量作為評價指標，確定最適合的發(fā)酵條件。正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.2 豆豉理化指標測定

食鹽含量的測定：根據(jù)GB 5009.44—2016的直接滴定法測定食鹽含量；蛋白質含量的測定：根據(jù)GB/T 5009.5—2016凱氏定氮法測定豆豉中的蛋白質含量；氨基酸態(tài)氮含量的測定：根據(jù)GB 5009.235—2016進行；總酸含量的測量：根據(jù)SB/T 10170—2007進行；水分的測定：根據(jù)GB/T 62846—2016進行。

1.3.3 感官指標

由10名感覺評價員組成評價小組，按照T/GZSX 014—2018豆豉規(guī)格的感官指標進行系統(tǒng)評價，評價結果如表2所示。

表2 毛霉型豆豉的感官評定結果

1.3.4 驗證試驗

利用正交試驗得到的最佳發(fā)酵工藝，在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進行豆豉后發(fā)酵，并對發(fā)酵結束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進行檢測驗證。

2 結果與討論

2.1 后發(fā)酵工藝單因素的試驗結果

2.1.1 食鹽添加量的確定

在豆豉后發(fā)酵過程中，食鹽的添加可有效抑制有害微生物的生長繁殖，能達到抑菌防腐的目的[7-8]。試驗選用豉曲按確定的制曲條件（菌粉接種量0.21%、制曲溫度17 ℃、發(fā)酵時間6 d、制曲相對濕度86% RH）處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時分別加入6.00%，7.50%，9.00%，10.50%和12.00%的食鹽（每組試驗3個平行），3.00%的醪糟酒，2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%，接種比例為1∶2），溫度35 ℃條件下發(fā)酵60 d，測定此時豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳食鹽添加量。

圖1為食鹽添加量對氨基態(tài)氮和總酸含量的影響研究結果。結果表明，當食鹽添加量為9.00%時，最終產品氨基酸態(tài)氮含量最大；當鹽濃度高于9.00%時，氨基酸態(tài)氮含量顯著降低（p＜0.05）；當鹽濃度高于10.00%時，總酸含量顯著降低（p＜0.05），原因可能是低濃度時，豉曲中的蛋白酶受到鹽的抑制作用較小，隨著鹽濃度的增加，微生物的生長受到抑制，進而影響酶系物質的活力，造成豉曲中分解產生的氨基酸等有機酸含量的減少，使得氨基酸態(tài)氮含量降低，對應的總酸含量也呈降低趨勢。

圖1 食鹽添加量對氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定

豆豉后發(fā)酵過程是大豆中的大分子物質蛋白質等在相應酵素的作用下生成氨基酸等物質的催化反應，溫度過低對催化反應的進行不利，溫度過高又會影響酶系統(tǒng)的活性，蛋白質的分解能力變弱[9-10]。試驗選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2%，接種比例為1∶2），在不同溫度（30，32，34，36和38 ℃，每組試驗3個平行）條件下發(fā)酵60 d，測定此時豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

由圖2可知，當溫度為35 ℃左右時，最終產品的氨基酸態(tài)氮和總酸含量為最高，而溫度繼續(xù)升高，會導致氨基酸態(tài)氮和總酸含量降低。由于溫度在35 ℃左右時蛋白酶活最高，蛋白酶活力高則分解蛋白質的能力強，豆豉中氨基態(tài)氮含量也對應升高，總酸含量也相應升高。因此，發(fā)酵溫度選擇在35 ℃左右。

圖2 發(fā)酵溫度對氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.3 乳酸菌和酵母菌接種比例的確定

乳酸菌產生的乳酸可以降低體系pH，促進酵母的繁殖。酵母菌在代謝過程中，不僅通過自身分解酶系水解淀粉成己糖，而且還可通過EMP途徑、無氧呼吸發(fā)酵產生酒精、甘油、糠醇、琥珀酸等物質，酒精也可以代謝成有機酸，或與有機酸等反應生成酯，這些物質都成為豆豉品香的重要來源[11]。試驗選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%），乳酸菌和酵母菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3（每組試驗3個平行），在溫度35 ℃條件下發(fā)酵60 d，測定此時豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳接種比例。

為了充分發(fā)揮乳酸菌和酵母菌對豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢，試驗優(yōu)先接種乳酸菌，然后在間隔30 d時，再接種酵母菌，兩種菌總的接種量為2.00%。探究兩種菌的最佳接種比例，結果如圖3所示。當接種比例為1∶2左右時，豆豉成品中的氨基酸態(tài)氮和總酸含量均為最多。因此，后續(xù)正交試驗考慮接種比例在1∶2左右。

圖3 接種比例對氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.1.4 發(fā)酵時間的確定

試驗選用豉曲按確定的制曲條件處理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料時加入9.00%的食鹽、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，發(fā)酵初期加入乳酸菌，在發(fā)酵30 d時加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接種量為2.00%，接種比例為1∶2），在溫度35 ℃條件下分別發(fā)酵45，52，59，66和72 d，測定此時豆豉的氨基態(tài)氮含量和總酸含量，確定最佳發(fā)酵時間。

從圖4可以看到，隨著發(fā)酵時間的增加，氨基酸態(tài)氮的含量和總酸含量逐漸增加，當發(fā)酵超過60 d時，氨基氮的含量緩慢增加而穩(wěn)定，有稍稍減少的傾向，但是發(fā)酵超過60 d，總酸含量顯著下降（p＜ 0.05），此時豆豉已發(fā)酵成熟。后發(fā)酵前期，由于在制曲階段積累的蛋白酶等酶的活性高，所生成的有機酸還沒有積蓄，所以抑制酶活性弱，蛋白質通過各種酵素的協(xié)調作用被分解為小分子的氮化化合物，氨基酸態(tài)氮雖然快速積累，但后發(fā)酵后期有機酸的大量增加，抑制了酶活性，激活了氨基酸。酸態(tài)氮含量的增加幅度變弱，最后趨于穩(wěn)定[12]。總酸的含量隨著游離氨基酸和有機酸的累積一直呈上升趨勢，酸度達到一定程度后，會反過來抑制酶的活性，進而導致分解的氨基酸降低[13]。因此，后續(xù)正交試驗考慮發(fā)酵時間在60 d左右。

圖4 發(fā)酵時間對氨基態(tài)氮和總酸含量的影響

2.2 優(yōu)化工藝條件下毛霉型豆豉成品質量檢測

2.2.1 毛霉型豆豉成品質量檢測

為保證優(yōu)化工藝條件下生產的毛霉型豆豉的質量，檢驗按照優(yōu)化工藝發(fā)酵的豆豉成品是否符合標準，以T/GZSX 014—2018豆豉標準為參考，對此次試驗的毛霉型豆豉進行成品質量檢測，結果如表3所示。結果顯示所有指標均符合相關標準。

表3 毛霉型豆豉產品質量檢測對照表

2.3 后發(fā)酵工藝正交優(yōu)化試驗結果

在單因素試驗的基礎上，設計L9(34)正交試驗，確定豆豉最佳后發(fā)酵條工藝條件。正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

從正交試驗的結果和方差分析的結果可以看出，影響氨基酸狀態(tài)氮的主要因素次序為D＞B＞A＞C，影響總酸含量的主要因素次序為B＞A＞D＞C。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對豆豉氨基酸狀態(tài)氮的含量有著極顯著的影響（p＜0.01）。食鹽的添加量、乳酸菌和酵母菌的接種比例對氨基酸狀態(tài)氮含量有著顯著的影響（0.01＜p＜0.05）。食鹽添加量、發(fā)酵溫度及時間對豆豉總酸含量有極為顯著的影響，乳酸菌和酵母菌的接種比例對總酸含量有顯著的影響[14]。考察各因素的極差Rj值，分別確定影響兩個指標因素的主次順序，同時結合水平結果平均值Kij確定兩指標下的最優(yōu)因素組合；針對氨基酸態(tài)氮，最佳因素組合為A2B2C1D2；針對總酸含量，最佳因素組合為A1B3C2D2。考慮到試驗是為了探究相關因素對最終產品風味品質的影響，綜合平衡選擇發(fā)酵的最佳組合為A2B3C1D2，即食鹽添加量9.00%，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1，發(fā)酵時間60 d。在此組合下發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮為0.93 g/100 g左右，總酸含量為2.08 g/100 g左右。

表4 發(fā)酵條件L9(34)正交試驗表

接表4

表5 方差分析

2.4 驗證試驗結果

采用單因素試驗和正交試驗得出豆豉后發(fā)酵最佳工藝條件：食鹽添加量9.00%，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1，發(fā)酵時間60 d。在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進行后發(fā)酵，并對發(fā)酵結束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進行檢測。4組豆豉成品氨基酸態(tài)氮含量平均值為0.95 g/100 g，與理論值0.93 g/100 g相差0.02 g/100 g；總酸含量平均值為2.02 g/100 g，與理論值相差0.06 g/100 g，表明在此優(yōu)化條件下發(fā)酵生產的豆豉方法可靠、質量穩(wěn)定。

3 結論

試驗以潼川傳統(tǒng)的毛霉型豆豉后發(fā)酵過程為基礎，把氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量作為評價指標，探討毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中的食鹽添加量、發(fā)酵溫度、乳酸菌和酵母菌接種比例、發(fā)酵時間等因素對氨基態(tài)氮含量和總酸含量的影響。并利用正交試驗得到最佳發(fā)酵工藝，在此條件下分別用5.00 kg（4組平行）豉曲進行豆豉后發(fā)酵，對發(fā)酵結束的毛霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量和總酸含量進行檢測驗證。從正交試驗的結果和方差分析的結果可以看出，影響氨基酸狀態(tài)氮的主要因素次序為發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞接種比例；影響總酸含量的主要因素次序為發(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞發(fā)酵時間＞接種比例。結果表明，最佳發(fā)酵條件為食鹽添加量9.00%、發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時間60 d、乳酸菌和酵母菌接種比例1∶1。在此組合下發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮在0.93 g/100 g左右，總酸含量在2.08 g/100 g左右。該研究可為今后霉型豆豉的后發(fā)酵工藝提供一定技術指導。