雙載體制備青蒿素速釋型固體分散體工藝優化研究

薛 昊，蘇婧鈺，陳文君，申雨玫，王可軒，李 鑫，陳 靖,3*，楊 波*

1哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076；2揚州大學醫學院(轉化醫學研究院)；3江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，揚州 225001

瘧疾是一種由瘧原蟲引起、按蚊傳播且在世界范圍內廣泛流行的一種致死率很高的惡性傳染病，瘧原蟲的循環性傳播及其復雜的生命周期，使瘧疾一直難以徹底根除,大多數傳統抗瘧藥如氯喹、奎寧、伯氨喹和哌喹等都先后出現耐藥性而失效，而青蒿素(artemisinin，ART)類抗瘧藥作用迅速，目前公認毒性較低，尚未出現明顯耐藥性而成為一線抗瘧藥[1,2]。ART為黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)葉中提取的一種倍半萜內酯類化合物[3,4]，不僅是目前治療瘧疾的唯一一線抗瘧藥物[5,6]，還具有抗病毒、免疫調節、抗炎、抗寄生蟲、抗真菌及抗腫瘤等多種生物活性[7-12]，但由于其水溶性和脂溶性均較差，屬難溶性藥物，體內吸收不完全，生物利用度較低，為有效解決這些制約青蒿素臨床應用的難題，近年來很多新方法被運用到青蒿素類藥物制劑中，其中固體分散體技術得到了人們的關注。

固體分散體(solid dispersion，SD)是將固體疏水原料藥以分子或微晶態分散在固體親水性惰性載體中所形成的分散系統[13]，可顯著增加藥物溶解度與溶出度，促進藥物的口服吸收，提高生物利用度[14]，還可通過選用適宜的載體及輔料，使藥物較為穩定的高度分散甚至進一步達到緩控釋效果。Ansari等[15]以PVP K30為單載體制備了二氫青蒿素固體分散體，發現二氫青蒿素與載體以非晶體復合物存在，溶解度比原料藥增加了50倍；Yang等[16]以泊洛沙姆188為最佳載體制備了吳茱萸堿固體分散體，可在不影響藥物含量與形態的基礎上大大提高藥物的溶出；Li等[17,18]分別以PEG 6000-卵磷脂為雙載體和Ⅲ號丙烯酸樹脂為單載體制得ART固體分散體(ART-SD)和緩釋型ART-SD。與單一載體相比，雙載體或二種以上載體組成混合載體制備固體分散體在調節藥物釋放速度及改善藥物溶出度方面可能更具優勢[19]，但目前為止載體類型是否對ART溶出度存在影響尚不明確，且以雙載體制備速釋型ART-SD工藝條件也未得到優化。本文選用固體分散體常用載體卵磷脂與PEG 6000或PVP K30為雙載體，比較了不同載體類型及比例對藥物溶出度的影響，優化了雙載體速釋型ART-SD制備工藝，并通過IR、DSC方法明確最優處方制備的固體分散體中藥物-載體的存在狀態，為提高難溶性藥物臨床療效奠定重要基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

ART(純度>98%，批號：20190112)購于阿拉丁試劑有限公司；PVP K30、氫氧化鈉購于國藥集團化學試劑有限公司；PEG 6000購于北京化工廠天津市福晨化學試劑廠；大豆卵磷脂購于上海藍季科技發展有限公司；無水乙醇購于天津市科密歐化學試劑有限公司；以上原輔料和試劑均為分析純，藥用輔料標準符合《中國藥典》(2020版)相關規定。

1.2 儀器

LE204E102電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；RE-52CS旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；RCZ-6B2型智能溶出度試驗儀(山東利達信儀器儀表設備有限公司)；200F3差示掃描量熱儀(德國Netzsch公司)；Lambda750紫外分光光度計(Perkin Elmer 公司)；DZF-6050真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 ART-SD制備

溶劑法制備：按一定質量比精密稱取ART與載體材料(大豆卵磷脂、PVP K30或PEG 6000)適量，加入到適量95%乙醇中溶解，并在20 ℃下攪拌30 min后，將其置于旋轉蒸發儀減壓蒸去溶劑至粘稠，于真空干燥箱50 ℃干燥24 h，最后將樣品置于預先清洗的研缽中，研磨均勻后，過80目篩，密封并于4 ℃保存。

2.1.2 物理混合物(physical mixture，PM)

按一定質量比精密稱取ART與載體材料適量，過80目篩，室溫下置于研缽內攪拌至混合均勻即得，密封并4 ℃保存。

2.2 固體分散體中ART定量分析

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 ART標準品溶液配制

精密稱取ART對照品5.00 mg，置于50 mL量瓶中，加入95%乙醇充分溶解并定容，即為0.1 mg/mL對照品貯備液。

分別精密吸取ART對照品貯備液1、2、4、6、8 mL于50 mL量瓶中，依次加入95%乙醇9、8、6、4、2 mL，0.2% NaOH溶液定容至50 mL，分別配成系列濃度分別為2、4、8、12、16 μg/mL的標準品溶液，50 ℃水浴加熱0.5 h，迅速取出冷卻，備用。

2.2.1.2 輔料空白溶液配制

精密稱取大豆卵磷脂、PVP K30與PEG 6000各5.00 mg，按照“2.2.1.1”項下配制輔料空白溶液。

2.2.1.3 供試品溶液配制

精密稱取ART-SD適量(0.100 0 g)，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇待充分溶解后定容至刻度。精密吸取該樣品母液6 mL，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇4 mL，0.2% NaOH溶液定容至50 mL，50 ℃水浴加熱0.5 h，迅速取出冷卻，配制成ART-SD供試品溶液，備用。

2.2.2 檢測波長選擇

以1 mL 95%乙醇與9 mL 0.2% NaOH混合液作為空白對照，掃描波長范圍200～500 nm，測定載體材料及ART對照品溶液吸收曲線，確定反應產物最大吸收波長，并考察載體材料是否對主藥檢測存在干擾。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 標準曲線制備

按照“2.2.2”項下確定的最適波長進行測定，以1 mL 95%乙醇與9 mL 0.2% NaOH混合液作為空白對照，測定不同濃度標準品溶液經反應后的吸光度值，以濃度(C)-吸光度(A)繪制標準曲線。

2.2.3.2 精密度試驗

取“2.2.1.1”項下16 μg/mL的標準品溶液，在最大吸收波長處于紫外分光光度計上連續測定吸光度值6次，計算日內精密度(RSD)。

2.2.3.3 穩定性試驗

取“2.2.1.1”項下16 μg/mL的標準品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，測定吸光度值，計算RSD。

2.2.3.4 重復性試驗

精密稱取同一批次ART-SD適量(含ART 5.00 mg)，取3份，按“2.2.1.3”項制備供試品溶液，測定吸光度值，標準曲線法測得樣品中ART濃度，并計算平均百分含量和RSD。

2.2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量ART-SD樣品9份(0.15 g)，分別加入高(12.0 μg/mL)、中(8.0 μg/mL)、低濃度(4.0 μg/mL)標準品溶液各3份適量，按“2.2.1.3”項制備供試品溶液，計算平均加樣回收率(%)和RSD。

2.2.3.6 樣品含量測定

取“2.2.1.3”項制備的供試品溶液，平行測定3次，標準曲線法測定樣品中ART濃度，分別按理論投料量及原料藥占制劑質量百分比，計算樣品中ART百分含量(%)及RSD。

2.3 體外溶出度的測定

ART-SD溶出度測定：根據2020版《中國藥典》第四部漿法通則。待溶出介質(超純水900 mL)溫度穩定為37 ℃，取適量ART-SD(相當于ART20 mg)粉末置于超純水中，轉速為100 rpm。分別于10、20、30、40、50 min取樣5 mL，及時補充溶出介質5 mL，樣品0.45 μm濾膜過濾。得續濾液適量，按上述含量測定方法測定ART濃度，計算累積溶出度并繪制溶出曲線。

2.4 處方篩選與優化

2.4.1 載體種類

按照8∶1固定比例精密稱取載體混合物和ART(分別以大豆卵磷脂與PEG 6000或大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7作為載體混合物)，按“2.1.1”項制備，考察載體種類對ART-SD溶出的影響。

2.4.2 大豆卵磷脂∶PVP K30復合載體比例

固定ART與大豆卵磷脂比例為1∶1，大豆卵磷脂和PVP K30比例分別為1∶5、1∶7、1∶9，按“2.1.1”項制備ART-SD，并考察復合載體比例對ART溶出度影響。

2.4.3 攪拌時間

載體∶藥物固定比例為8∶1，復合載體比例選取大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7，選取攪拌時間分別為20、30、40 min，考察反應時間對ART溶出度影響。

2.4.4 溶劑用量

載體∶藥物固定比例為8∶1，復合載體比例選取大豆卵磷脂與PVP K30比例為1∶7，分別加入到溶液體積分別20、30、40 mL的95%乙醇中，按“2.1.1”項制備，并考察溶劑用量對ART溶出度影響。

2.5 物相表征

2.5.1 差示掃描量熱法(DSC)

將ART、PVP K30、大豆卵磷脂、PM及ART-SD粉末分別進行DSC分析。以一只坩堝作為空白參比，另一只坩堝中放入5.00～6.00 mg樣品，測量條件：氛圍氣為氮氣，10 ℃/min升溫，溫度范圍20～200 ℃掃描，得到不同樣品的DSC曲線。

2.5.2 紅外光譜(IR)

采用溴化鉀壓片法將ART、PVP K30、大豆卵磷脂、PM及ART-SD粉末分別制備成樣品后進行紅外掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，得到不同樣品的紅外光譜，進行光譜分析。

2.6 統計方法

3 結果與分析

3.1 檢測波長的確定

由圖1A可以看出，ART在292 nm處吸光度最強，僅在紫外區203 nm處有較弱的末端吸收，這是由于50 ℃時ART在0.2% NaOH溶液中，定量生成α，β-不飽和酮酸鹽，得到一吸收峰在292 nm處的產物。而由圖1B、C、D可以看出，輔料在292 nm處無吸收，對測定無干擾，故本實驗選擇292 nm為ART含量檢測波長。

圖1 紫外掃描圖

3.2 方法學考察

3.2.1 標準曲線的繪制

不同濃度標準品吸光度值見表1，標準曲線如圖2，回歸方程為：A=0.055C+0.108 5，r2=0.999 6(n=5)，結果表明ART在2.0～16.0 μg/mL范圍內濃度與吸光度線性關系良好。

圖2 ART標準曲線

表1 不同濃度標準品吸光度值

3.2.2 精密度

如表2所示精密度實驗結果，RSD小于1%，表明方法精密度良好。

表2 精密度實驗(n=6)

3.2.3 穩定性

如表3穩定性實驗結果，RSD小于1%，表示測定標準品溶液在24 h內穩定性良好。

表3 穩定性測定結果(n=8)

3.2.4 重復性

如表4重復性實驗結果，按理論投料量或占總制劑含量計算RSD均小于2%，表明方法重復性良好。

表4 重復性測定結果(n=5)

3.2.5 加樣回收率

如表5所示，低、中、高濃度的溶液平均加樣回收率分別為98.33%、98.11%、98.12%，RSD小于2%，符合方法學要求。

表5 加樣回收率(n=3)

3.3 含量測定

由表6數據可知，按“2.2.1.3”項制備的ART-SD中ART含量均值按理論投料量計算為94.97%±0.31%，按原料藥占制劑總質量百分比為10.55%±0.04%，RSD為0.28%。

表6 ART-SD中ART含量測定結果(n=3)

3.4 處方優化結果

3.4.1 雙載體種類篩選

由圖3和表7可以看出，在50 min內，使用大豆卵磷脂和PVP K30作為雙載體的溶出度和溶出速率均高于大豆卵磷脂和PEG 6000，故選擇大豆卵磷脂和PVP K30為復合載體。

表7 不同雙載體影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖3 不同雙載體影響ART累積溶出曲線

3.4.2 復合載體比例篩選

由圖4和表8可以看出，溶出速率和溶出度均有差異，且在溶出30 min后，溶出度趨于穩定。當大豆卵磷脂和PVP K30比例低于1∶7時，固體分散體的溶出度和溶出速率與載體比例成正比。當大豆卵磷脂和PVP K30比例高于1∶7時，固體分散體的溶出速率和溶出度基本不變，分析原因是青蒿素已充足分散于載體中，故增加PVP K30用量對分散度無影響。故選擇混合載體大豆卵磷脂和PVP K30比例為1∶7。

表8 不同載體比例影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖4 不同載體比例影響ART溶出曲線

3.4.3 攪拌時間篩選

由圖5和表9可以看出，攪拌時間在20～30 min之間時，隨著攪拌時間的延長，溶出度也隨之增加。但攪拌時間在30～40 min之間時，溶出度基本無變化。分析原因可能是當攪拌時間小于30 min時，ART部分以微晶形式存在，達到30 min后，ART多以無定型形態分散于載體中，故選擇30 min為反應時間。

圖5 不同攪拌時間影響ART溶出曲線

表9 不同攪拌時間影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.4.4 溶劑用量篩選

由圖6和表10可以看出，當ART和載體充分溶解在溶劑中，在一定限度內，溶劑量的增加并不會影響溶出度。考慮到成本及安全性，故選擇95%乙醇量為20 mL。

表10 不同溶劑用量影響ART累積溶出百分率測定結果(n=3)

圖6 不同溶劑用量影響ART溶出曲線

3.4.5 ART-SD最優處方

通過上述實驗，ART-SD最優處方為：稱取50 mg ART，50 mg大豆卵磷脂，350 mgPVP K30(ART∶大豆卵磷脂∶PVP K30 = 1∶1∶7)，溶于20 mL 95%乙醇中，攪拌30 min后于旋轉蒸發儀上蒸發至粘稠后置于真空干燥箱中，50 ℃干燥24 h，研磨均勻后，過80目篩后，密封并在4 ℃冰箱保存。

3.4.6 最優處方驗證

由圖7和表11可知ART-SD在30 min內快速溶出，30 min后達到溶出平衡，總溶出度超過87%，且三批樣品的溶出曲線一致，說明該方法制劑重現性良好。ART原料藥50 min內溶出度小于0.06%，說明雙載體制備的速釋型ART-SD能顯著提高ART溶出度。

圖7 不同批次制備ART-SD和ART原料藥溶出度曲線差異

表11 不同批次制備ART-SD和ART原料藥累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.5 物相表征

3.5.1 體外溶出對比

由圖8不同樣品的溶出曲線可以看出，在50 min內，ART原料藥在溶出介質中不溶，制備成ART-SD后，明顯改善了溶出度。相比于ART原料藥，物理混合物(PM)中藥物的溶出度基本不變，說明載體對主藥只起到輕微的助溶作用。

圖8 青蒿素固體分散體、物理混合物及原料藥累積溶出曲線差異

3.5.2 差示掃描量熱法(DSC)

由圖9可見，ART在152.6 ℃存在尖銳的吸熱峰，PVP K30在108 ℃左右有一個峰寬不對稱的吸收峰，由于它是親水性聚合物，在該溫度下脫水而產生的峰。大豆卵磷脂沒有明顯的吸收峰，由于它具有無熔點且無固定形態的特性。PM在150 ℃和105 ℃附近有兩個吸收峰，說明ART與載體只是混合且并未改變晶型。ART-SD無明顯吸收峰，說明藥物晶型發生了改變，載體與ART間形成了固體分散體。

圖9 差示掃描圖

表12 青蒿素固體分散體、物理混合物及原料藥累積溶出百分率測定結果(n=3)

3.5.3 紅外光譜法(IR)

由圖10可見，ART在1 738、1 116、724、2 870～3 000、1 450～1 380 cm-1有吸收峰，分別是C=O、C-O-C、O-O、C-H，C-H鍵的伸縮振動；只有1 738 cm-1的C-O伸縮振動峰較強，峰形較好，周圍無其他干擾峰。PVP K30在1 655、2 950、1 289 cm-1有吸收峰，分別是C=O的伸縮振動、C-H的伸縮振動、C-N的伸縮振動，在3 446 cm-1寬且強的吸收峰是由于分子吸收了水分。大豆卵磷脂在1 738 cm-1有吸收峰(C=O的伸縮振動)。PVP分子和大豆卵磷脂中均有羰基，因而可以和ART分子中苯環上的氫形成氫鍵。PM的羰基峰仍與PVP分子和大豆卵磷脂一致(1 655、1 738 cm-1)，說明ART與載體只是簡單的混合。而ART-SD的羰基峰在1 653、1 735 cm-1，表明ART與載體間可能形成氫鍵，生成了固體分散體，使吸收峰發生了紅移。

圖10 紅外吸收光譜圖譜

4 討論

固體分散體技術通過將藥物高度分散在適宜的載體材料中，并以無定型態、微晶態、分子分散態或膠體分散態存在，與胃腸液接觸后，藥物溶出速度加快，促進藥物吸收，提高生物利用度，以改善難溶性藥物口服吸收差的難題。根據載體性質和釋藥特點的不同，固體分散體又分為速釋型、緩控釋型和腸溶型固體分散體。本文選取親水性載體材料，利用其良好的潤濕性，使ART從速釋型ART-SD中快速被釋放，50 min內溶出度遠高于物理混合物和ART原料藥，有利于解決ART口服給藥吸收不完全的缺點。

其次，雙載體較單一載體可更大程度地增加藥物的溶出，大豆卵磷脂具有增溶性，PVP K30具有增加潤濕性、降低溶出介質的表面張力、抑制藥物結晶的特點[20,21]，在提高難溶性藥物的溶出方面廣泛選用PVP K30，而PEG 6000亦被用來與卵磷脂混合作為雙載體用于制備ART-SD，但不同復合載體對ART從ART-SD中溶出度影響目前并不明確，雙載體制備ART-SD工藝條件也尚未進行優化。本文通過考察卵磷脂分別與PVP K30、PEG 6000組合成雙載體后對ART溶出度影響，發現卵磷脂-PVP K30更優，并確定了二者的比例，在此基礎上，進行了雙載體溶劑法制備速釋型ART-SD工藝條件優化，為ART新劑型開發奠定重要基礎。

5 結論

本實驗以ART溶出度為評價指標，通過單因素篩選雙載體種類、復合載體比例、反應時間、溶劑用量等，確定雙載體制備速釋型ART-SD的最優處方為：50 mg ART，50 mg大豆卵磷脂，350 mg PVP K30(大豆卵磷脂和PVP K30比例1∶7)，按最優工藝制得固體分散體中藥物含量為10.55%±0.04%，在30 min時達到溶出平衡，50 min內溶出度為87.21%±2.28%，顯著高于PM 3.45%±1.68%和ART原料藥0.05%±0.15%。DSC和IR分析表明ART與載體之間形成氫鍵且以新的無定型狀態存在，后續將深入研究ART-SD是否能夠改善ART作為難溶性藥物口服生物利用度低的不足，提高抗瘧活性，為臨床提供更為有效的抗瘧藥物。