四川省煙草靶斑病病原鑒定及生物防治研究

徐傳濤，張 崇，張明金，謝 強(qiáng)，彭 勇，張永輝，夏建華，夏 春，夏 博，顧 勇，吳元華

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161；2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000）

煙草是四川省重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，全省常年種植面積約8 萬hm2。近年來，由于煙區(qū)氣候條件的變化，煙草新病害在四川省煙區(qū)時(shí)有發(fā)生。煙草靶斑病是近年來在四川省煙區(qū)新發(fā)生的一種病害，其具有發(fā)生面積廣、病害傳播迅速、經(jīng)濟(jì)損失巨大等特點(diǎn)。煙草靶斑病是由瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］、無性世代為立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）的病原物引起的真菌病害［1］。該病是由 COSTA 于 1948 年在巴西首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［2］，此后哥斯達(dá)黎加、美國、南非、津巴布韋也相繼報(bào)道了該病害的發(fā)生［3-6］。吳元華等［7］在遼寧省煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了煙草靶斑病在中國的發(fā)生與危害。此后，廣西［8］、云南［9］等煙區(qū)相繼報(bào)道煙草靶斑病的發(fā)生。2018 年在對(duì)四川省煙草病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，四川省瀘州市古藺縣和敘永縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)煙草種植田塊靶斑病大面積發(fā)生，一般田塊減產(chǎn)15%～20%，嚴(yán)重田塊減產(chǎn)高達(dá)90%以上，Xia 等［10］首次報(bào)道了該病害在四川省的發(fā)生。本研究進(jìn)一步對(duì)四川省瀘州市各煙草種植鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集病樣，對(duì)其病原菌進(jìn)行分離鑒定，并明確其菌絲融合群類型，同時(shí)選用幾種生物農(nóng)藥開展田間防治試驗(yàn)，以期為煙區(qū)有效控制病害的發(fā)生蔓延提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 樣本為2018 年和2019 年采自四川省瀘州市古藺縣和敘永縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)煙草種植田塊，經(jīng)分離純化得到41 株菌株（表1）。立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病毒室保存（AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8 和 AG-9）。

表1 病原菌分離株及其采集地點(diǎn)

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，去離子水1 000 mL

1.1.3 供試品種 云煙87。

1.1.4 供試藥劑 10%井岡霉素水劑、105億CFU/g多粘·枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、10 億CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑、100 億CFU/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，遼寧省沈陽紅旗林藥有限公司；3%多抗霉素水劑，遼寧省沈陽中科生物工程有限公司；40%菌核凈可濕性粉劑（對(duì)照藥劑），一帆生物科技集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 在新采集的病葉上，選取典型的單個(gè)病斑，從病斑邊緣或病健交界處分離病原菌，將病原菌置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)1～2 d。待菌絲長出后，參照鑒定標(biāo)準(zhǔn)［11］，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。切取單枝菌絲尖端，置于PDA 斜面上進(jìn)行單菌絲分離與純化培養(yǎng)，以獲得該菌株的純培養(yǎng)物，并對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)保存。

1.2.2 病原菌致病性測定 采用柯赫氏（Koch）證病規(guī)則進(jìn)行接種試驗(yàn)，將純化后的病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，菌落邊緣打取直徑6 mm 菌餅，針刺接種于經(jīng)75%乙醇表面消毒后的云煙87 煙草葉片上，采用無菌水浸濕脫脂棉覆膜保濕，以直徑6 mm的PDA 瓊脂塊接種云煙87 煙草葉片作為對(duì)照，每處理15 片，3 次重復(fù)。接種3 d 后移除菌絲塊，觀察葉片發(fā)病情況，再次于病健交界處分離病菌，與接種病原菌進(jìn)行形態(tài)比較。

1.2.3 菌絲融合群的鑒定 采用玻片配對(duì)法進(jìn)行鑒定，將待測菌株分別與各融合群標(biāo)準(zhǔn)測試菌株配對(duì)，進(jìn)行融合觀察。

1.2.4 田間病害防治

1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。2019 年試驗(yàn)地點(diǎn)為瀘州市敘永縣營山鎮(zhèn)，土壤肥力均等；每種藥劑設(shè)置1 個(gè)處理，即：A.10%井岡霉素水劑（稀釋800 倍）；B.105億CFU/g 多粘·枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（稀釋500倍）；C.10 億CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑（稀釋500 倍）；D.100 億 CFU/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（稀釋500倍）；E.3%多抗霉素水劑（稀釋500倍）；F.對(duì)照藥劑40%菌核凈可濕性粉劑（稀釋600 倍）；G.以等量清水處理為空白對(duì)照。每個(gè)處理120 株，重復(fù)3次。間隔7 d 施藥1 次，共計(jì)施藥2 次。

2）調(diào)查方法。第2 次施藥7 d 后，每小區(qū)采用5點(diǎn)取樣方法，每點(diǎn)調(diào)查10 株，記錄調(diào)查總株數(shù)或總?cè)~片數(shù)及各級(jí)病葉數(shù)，進(jìn)行病害分級(jí)。

煙草靶斑病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］：0 級(jí)，無??；1 級(jí)，病斑面積占葉片面積的1%以下；3 級(jí)，病斑面積占葉片面積的1%～10%；5 級(jí)，病斑面積占葉片面積的11%～30%；7 級(jí)，病斑面積占葉片面積的31%～50%；9 級(jí)，病斑面積占葉片面積的51%以上。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

3）數(shù)據(jù)處理。采用 SPSS 22、Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 立枯絲核菌的分離與鑒定

從四川省瀘州市各煙草種植區(qū)采集的煙草靶斑病樣品上分離純化得到41株菌株，其形態(tài)與Parmeter等［12］對(duì)立枯絲核菌的描述相符合。如圖1 所示，菌絲粗壯、有分隔，直徑為7～12 μm。初生菌絲粗壯，最初與主枝夾角約45°，隨著菌絲老熟變?yōu)樽攸S至褐色，菌絲間夾角約為90°，分枝處有明顯縊縮，且有隔膜與母菌絲隔開，染色結(jié)果表明，菌絲細(xì)胞為多核。綜合鏡檢和培養(yǎng)菌絲形態(tài)觀察，認(rèn)為該病原菌為立枯絲核菌，屬半知菌門無胞菌目絲核菌屬。

2.2 致病性測定

接種3 d 后觀察癥狀與田間癥狀基本一致。即初侵染病斑為水漬狀，病斑直徑為0.5～2.0 cm 且不規(guī)則，病斑內(nèi)幾乎透明，有同心輪紋，并形成退綠暈圈，病斑壞死，部分有穿孔。在葉片背面，有的是葉片正面的病斑邊緣，著生呈奶油色至灰白色的子實(shí)層和擔(dān)孢子。自病健交界處再次分離獲得病原菌。經(jīng)鏡檢與菌絲融合測定，結(jié)果表明，再次分離獲得病原菌與原接種菌株相同的病原菌（圖2）。

圖1 煙草靶斑病病原菌菌落及菌絲

圖2 接種煙草靶斑病菌5 d 后癥狀

2.3 立枯絲核菌菌絲融合群測定

采用玻片配對(duì)法測定供試菌株菌絲融合群，試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，供試菌株全部與AG-3 標(biāo)準(zhǔn)菌株融合，即兩菌絲接觸細(xì)胞間細(xì)胞壁溶解，細(xì)胞質(zhì)相互融合，細(xì)胞核流入另一菌絲內(nèi)；卻不與AG-1-IA、AG-2-1、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9 等標(biāo)準(zhǔn)菌株融合。表明四川省瀘州市煙區(qū)采集到的煙草靶斑病病原菌即立枯絲核菌應(yīng)歸入AG-3 融合群。

圖3 菌絲融合反應(yīng)

2.4 田間防治效果

5 種生物藥劑對(duì)煙草靶斑病的田間防治效果（表2）表明，10%井岡霉素水劑防治效果最好，可達(dá)77.08%，明顯優(yōu)于供試對(duì)照藥劑40%菌核凈可濕性粉劑；10 億CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑和105億CFU/g 多粘·枯草芽孢桿菌可濕性粉劑次之，防效分別達(dá)69.40%和63.75%，二者差異不顯著，但也明顯優(yōu)于供試對(duì)照藥劑40%菌核凈可濕性粉劑；其他幾種藥劑防治效果不理想。

表2 不同藥劑對(duì)田間煙草靶斑病的防治效果

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)病原菌的分離鑒定，表明瀘州市煙區(qū)的煙草靶斑病病原菌均為瓜亡隔菌，無性世代為立枯絲核菌，病害田間癥狀由于易與赤星病、野火病混淆，極易造成誤診。據(jù)報(bào)道，適宜的溫度，較高的相對(duì)濕度、煙葉葉片長時(shí)間處于濕潤條件有利于病害的發(fā)生、流行。經(jīng)調(diào)查，瀘州市煙區(qū)近年來8—9 月連續(xù)陰雨，氣溫偏低、空氣濕度大、清晨易出現(xiàn)葉片結(jié)露現(xiàn)象，此條件與北卡羅來納州靶斑病大發(fā)生的氣候特點(diǎn)相似［12］。

樣品來源的不同對(duì)煙草靶斑病病原菌的融合群構(gòu)成存在一定影響。國外報(bào)道指出，采自美國北卡羅來納州的病菌屬于AG-2-2 融合群［13］，而采自美國康乃迪克州、馬薩諸塞州的病原菌菌株屬于AG-3 融合群［14，15］。國內(nèi)報(bào)道采自遼寧省丹東市和鐵嶺市、黑龍江省、云南省煙區(qū)的病原菌菌株屬于AG-3融合群［9，16，17］，國內(nèi)首次從廣西省煙區(qū)煙草靶斑病組織上分離到 AG-2 和 AG-4 融合群［8］。本研究從四川省瀘州市煙區(qū)各地分離得到的煙草靶斑病菌，經(jīng)過菌絲融合群測定均為AG-3 融合群。

生物防治是一種高效、安全的防治植物病害的方法，具有對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性好、保護(hù)生物多樣性、不易產(chǎn)生抗性及來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。為此本研究選用市售5 種生物藥劑對(duì)田間煙草靶斑病進(jìn)行防治試驗(yàn)，結(jié)果表明，10%井岡霉素水劑對(duì)田間病害的防治具有顯著效果，防效可達(dá)77.08%，其次為10 億CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑、105億CFU/g 多粘·枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，防效分別為69.40%、63.75%。因此，可在生產(chǎn)上選用以上3 種藥劑防治煙草靶斑病。