黃芪多糖在小鼠肝臟脂肪變性中的作用

王春花，孫雪芳

（牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157000）

脂肪肝是以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為主要特征的病理綜合征，為圍產期奶牛和籠養蛋雞的常見疾病，發病率分別為10%～50%和5%～30%，病死率為25%和10%［1-3］，不僅對養殖業造成嚴重危害，也嚴重影響了寵物與人類的健康。全球人類非酒精性脂肪（NAFLD）肝患病率高達25.24%［4］，在中國非酒精性脂肪肝已經替代乙型肝炎成為最常見的慢性肝病［5］，有效防治脂肪肝已成為保障養殖業、寵物與人類公共健康的重大課題。目前治療脂肪肝的手段相對比較局限，可應用的有效藥物更是匱乏，臨床發現通過改善飲食、減少環境應急結合降脂類中藥可以降低脂肪肝發病率［6-8］，找到一種無毒、價廉、高效預防脂肪肝的新型飼料添加劑成為有效控制脂肪肝的關鍵。

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides）是中藥黃芪的主要有效成分，具有調節免疫、改善腸道菌群、降脂、降糖等作用［9-11］，可作為動物飼料添加劑以提高動物生長性能、改善動物產品品質、緩解熱應激和提高動物免疫功能［12-14］。黃芪多糖因其廣泛的抗菌、抗病毒作用，常被作為抗生素的替代品用于動物疫病的防治［15-17］，避免了抗生素濫用引起的藥物殘留和耐藥性的產生，通過黃芪多糖替代抗生素來防治動物疫病成為目前研究的熱點。研究發現，黃芪多糖可降低高脂飼料誘導的大鼠肝臟脂肪病變程度［18］，顯著降低泌乳期奶牛血清甘油三酯（TG）含量［19］，但其機制并不清楚，還有待研究揭示。Toll 樣受體4（TLR4）在脂肪肝發生發展過程中起到至關重要的作用［20］，通過調控TLR4 干預脂肪肝已成為目前防治脂肪肝研究的熱點［21］。研究顯示，黃芪多糖可以通過調控TLR4 抑制脂多糖誘導的大鼠心肌細胞肥大［22］和慢阻肺炎癥反應［23］，黃芪多糖干預肝臟脂肪變性是否與調控TLR4 有關并未見報道。本試驗通過高脂結合果糖飲食誘導脂肪變性小鼠模型觀察黃芪多糖的預防作用，并通過檢測腸道通透性與肝臟TLR4 和MyD88 蛋白的表達探討黃芪多糖對脂肪變性小鼠的預防機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級ICR 小鼠30 只［購于哈爾濱醫科大學實驗動物學部，許可證號：SCXK（黑）2013-001］，雄性，8 周齡，體質量30～33 g，飼養于牡丹江師范學院動物實驗室。

1.1.2 主要試劑 高脂飼料為自制；黃芪多糖購于廣東紅泰生物科技有限公司；HE 染色試劑盒購于江蘇綠葉生物科技有限公司，4 kD 熒光素標記葡聚糖購于Sigma 公司；TLR4 與MyD88 抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 生化分析儀（U-8021A 型，桂林優利特有限公司）、離心機（H2500R 型，湖南湘儀離心機有限公司）、電子天平（AX523ZH 型，西杰天平儀器有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與樣本采集 30 只雄性ICR 小鼠隨機分成3 組，每組10 只，分為正常組、模型組、黃芪多糖預防組（400 mg/kg）。適應性喂養動物1 周后，除正常組喂食普通飼料外，其余各組小鼠均飼喂高脂飼料與30%果糖水8 周，飲水自由攝取。造模同時小鼠每日按400 mg/kg 劑量灌胃黃芪多糖，給藥體積為0.5 mL/30 g體質量，正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續給藥8 周。

在第8 周最后一次給藥后，各組小鼠禁食12 h，各組隨機選取5 只小鼠按0.6 mg/g 體重灌胃熒光素標記葡聚糖（FITC-Dextran，4 kD）的溶液，4 h 后稱體質量，眼球采血，4 ℃1 500 r/min離心10 min分離血清（未灌胃FITC-Dextran 溶液小鼠），4 ℃ 4 000 r/min離心10 min分離血漿（灌胃FITC-Dextran溶液小鼠），-80 ℃保存，用于血清與血漿相關指標測定。采血后頸椎脫臼處死小鼠，解剖觀察肝臟外觀，稱重后肝臟組織石蠟包埋，肝臟組織余下部分存于-80 ℃，用于肝臟組織TLR4 蛋白質的檢測。

1.2.2 一般指標 每周對小鼠體質量進行測定與記錄，計算肝臟指數，觀察各組小鼠皮毛光澤和精神狀態，小鼠肝臟指數計算公式如下：

肝臟指數=［小鼠肝臟質量（g）/小鼠體質量（g）］×100%

1.2.3 肝臟組織病理學的檢測 小鼠處死后，解剖觀察并記錄肝臟外觀形態與病變情況。肝臟組織以10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，制備肝臟組織切片，HE 染色后在光鏡下觀察肝臟脂肪變性程度。

1.2.4 血清生化指標與血漿中FITC-Dextran 的檢測 采用生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和葡萄糖（GLU）。

利用多功能酶標儀（激發光波長485 nm，發射波長528 nm）測定FITC-Dextran 標準品與血漿中FITC-Dextran 的吸光度，繪制標準曲線，計算血漿中FITC-Dextran 含量。

1.2.5 肝臟組織中TLR4、MyD88蛋白水平的檢測 肝臟組織放于RIPA蛋白裂解液中研磨裂解，13 000 r/min離心15 min，取總蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離后轉膜，TBS 沖洗后加 5%BSA 封閉，振蕩培養 2 h，洗膜、加入 TLR4、MyD88 一抗稀釋液置 4 ℃過夜，洗膜、加HPR 標記的二抗稀釋液，室溫培養2 h，洗膜、滴加ECL 放置培養1 min，顯色后利用Image Quant Las 4 000 mini 拍照并分析條帶灰度值。以TLR4、MyD88 和β-actin 條帶灰度值的比值作為TLR4、MyD88 的表達水平。

1.2.6 數據處理方法 試驗數據使用SPSS13.0 軟件分析處理，結果以表示，采取組間t檢驗，P＜0.05 表示各組數據間差異顯著，P＜0.01 表示各組數據間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 一般指標情況

正常組小鼠體重穩定增加，行為活躍，精神狀態好。模型組小鼠體重快速增加，體型肥胖，不喜歡活動，時有發蔫現象發生。黃芪多糖預防組小鼠體重緩慢增加，小鼠體型類似正常組，精神狀態良好。從表1 可以看出，與正常組比較，模型組小鼠體質量（P＜0.05），肝濕重（P＜0.01）和肝臟指數（P＜0.05）顯著增加；與模型組比較，黃芪多糖預防組小鼠體重（P＜0.05）和肝濕重（P＜0.01）顯著降低。解剖后觀察小鼠肝臟形態，模型組小鼠肝臟外觀顏色變黃油膩，對比模型組與正常組，黃芪多糖預防組小鼠肝臟外觀顏色更接近正常組，說明黃芪多糖預防后肝臟脂肪變性程度有所緩解（圖1）。

表1 各組小鼠體重、肝濕重和肝臟指數比較

圖1 小鼠解剖狀態

2.2 黃芪多糖對小鼠肝功能與血脂血糖水平的影響

如圖2 所示，對比正常組，模型組小鼠血清ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.01）和 ALP（P＞0.05）水平均升高；對比模型組，黃芪多糖預防組小鼠血清ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.05）和 ALP（P＞0.05）水平均降低。對比正常組，模型組小鼠血清GLU（P＜0.05）、TC（P＜0.01）和 TG（P＞0.05）水平升高。對比模型組，黃芪多糖預防組小鼠GLU（P＜0.05）、TC（P＜0.05）和TC（P＜0.05）水平均顯著降低。對比正常組，模型組小鼠血清LDL（P＜0.01）和HDL（P＜0.01）明顯升高。對比模型組，黃芪多糖預防組小鼠LDL（P＞0.05）和HDL（P＜0.01）升高。

2.3 黃芪多糖對小鼠肝臟組織細胞形態的影響

如圖3 所示，正常組小鼠肝臟小葉結構完整，肝細胞排列整齊，以中央靜脈為中心肝細胞呈放射性排列，邊界清晰，未見明顯病變。在肝細胞內細胞核結構清晰，胞內胞質均勻，無脂肪滴堆積，無肝細胞腫脹、脂肪變性現象。模型組小鼠肝細胞界限模糊不清，排列混亂，體積增大、腫脹，脂肪滴彌漫性浸潤，可見肝細胞內大小、數量不均的脂滴空泡存在。黃芪多糖預防組小鼠肝臟的脂肪浸潤程度顯著下降，肝細胞排列緊密，黃芪多糖預防給藥可減少高脂高糖誘導的肝臟脂肪變性程度，減少肝臟內脂肪的積累。

圖2 小鼠血清中ALT、AST、ALP、TG、TC、GLU、LDL 和 HDL 的 表達 水 平

圖3 小鼠肝臟組織病理（100×）

2.4 黃芪多糖對小腸通透性的影響

如圖4 所示，對比正常組，模型組小鼠血漿中FITC-Dextran 含量較正常組小鼠含量顯著升高（P＜0.01），說明模型組小鼠腸道通透性增加。對比模型組，黃芪多糖預防組小鼠血漿中含量下降，接近于正常小鼠，表明黃芪多糖能有效減小腸道通透性，改善腸道屏障。

圖4 小鼠血漿中FITC-Dextran 的含量

2.5 黃芪多糖對肝臟TLR4 與MyD88 蛋白表達的影響

如圖5 所示，對比正常組，模型組小鼠肝臟中TLR4 蛋白表達量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖預防組小鼠肝臟TLR4 蛋白表達量顯著減少（P＜0.01）。對比正常組，模型組小鼠肝臟中MyD88 蛋白表達量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖預防組小鼠肝臟MyD88 蛋白表達量極顯著減少（P＜0.01），接近于正常組小鼠MyD88 蛋白表達量。

3 小結與討論

本試驗以小鼠為實驗動物研究黃芪多糖預防給藥對肝臟脂肪變性的干預作用，為黃芪多糖作為新型添加劑用于預防高危時期動物脂肪肝的發生提供基礎。研究顯示，TG、GLU、AST 等可用于綿羊、奶牛脂肪肝發生風險的評估［24，25］，臨床上也常檢測 TG、TC、ALT 和AST 水平用于脂肪肝診斷。結果顯示，預防組小鼠肝臟脂肪病變程度明顯減輕，血清指標ALT、AST、ALP、TG、TC 和 GLU 水平顯著降低，以上結果與唐姣玉等［10］報道的黃芪多糖干預大鼠高脂模型的血清生化指標、泌乳期奶牛血清TG 指標一致，說明預防給藥黃芪多糖對飲食誘導引起的肝臟脂肪變性具有抑制作用，添加在飼料中可干預動物脂肪肝的發生［26］。

圖5 小鼠肝臟TLR4 和MyD88 蛋白的相對表達量

脂肪肝的發病機制復雜，至今尚未闡明，Tilg等［20］提出的“二次打擊”學說被認為是人類NAFLD發病機制的經典學說，隨著研究的深入，由胰島素抵抗、腸道菌群失調、免疫改變等組成的“多重打擊”被越來越多學者支持，為動物脂肪肝發病機制的研究提供了基礎與方向。TLR4在“多重打擊”過程中起到至關重要的作用，TLR4 信號轉導通路包括依賴性MyD88 和非依賴性MyD88 兩條通路，在依賴性MyD88 途徑中，TLR4 與特異性配體相互識別后，通過直接接觸或間接募集的方式活化MyD88，激活IKK/NF-κB 及絲裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）信號途徑，引起炎性介質合成與釋放，促進肝內脂肪堆積，胰島素抵抗，炎癥和纖維化過程參與NAFLD 的發生發展［27-29］。黏膜屏障功能下降，腸道通透性增加，可導致腸源性脂多糖LPS 隨血液經門靜脈進入肝臟，與脂多糖受體LPB、CD14 結合形成三元復合物，激活肝臟TLR4 相關信號通路。肝內TLR4 激活后通過調節脂肪代謝酶如SCD1、CPT-1、ACOX1 等，使肝臟脂肪合成增加，促進了脂質積累和脂肪變性的發生。本研究發現黃芪多糖可有效預防飲食誘導的小鼠脂肪肝的發生，黃芪多糖預防給藥后模型小鼠腸道通透性減小，肝臟TLR4 和MyD88 蛋白表達水平下降，這些結果提示黃芪多糖很可能是通過改善腸道屏障，減少腸源性TLR4 激活物進入肝臟激活TLR4，抑制TLR4/MyD88 通路介導的肝內脂肪堆積過程，減小肝臟脂肪變性程度，從而發揮預防脂肪肝作用。同時，下調肝臟TLR4 蛋白的表達還可以抑制腸源性LPS 激活介導的NF-κB 信號通路和神經酰胺/pkcθ 信號通路，通過減少細胞因子和趨化因子的合成與釋放、抑制IRS1/2 的絲氨酸磷酸化和蛋白質體降解預防脂肪肝的進一步發展。