柴胡中柴胡皂苷c、a、d 含量測定方法的建立

盧麗香，周世友，曾海生，趙鳳仙，楊桂林，譚雨坪

（1.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000；2.廣西中醫藥大學，南寧 530200）

柴胡始載于《神農本草經》，列為上品，別名茈胡、地薰。中國藥典規定柴胡（Bupleurum ChinenseDC.）或狹葉柴胡（B.scorzonerifoliumWilld.）為正品，供藥用，二者一般習稱為“北柴胡”及“南柴胡”［1］。藥用部分為柴胡的根或全草，具有解表和里、疏肝解郁、升提中氣之功效。主治感冒發熱、寒熱往來、黃疸肝炎及月經不調等［2］。

柴胡主要有效成分為柴胡皂苷、揮發油、黃酮、脂肪酸等成分［3］。目前已經從柴胡不同部位分離到柴胡皂苷（saikosaponins）a～d 等［4］。研究表明，柴胡皂苷具有解熱、鎮靜、抗炎、免疫調節、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性［5］，柴胡皂苷a、d為其主要活性成分，并且柴胡皂苷 d 的藥理活性最強［6，7］。本研究采用高效液相色譜法，以蒸發光散射檢測器進行檢測，對柴胡藥材中柴胡皂苷c、a、d 進行了含量測定，以建立測定柴胡根3 種皂苷含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司，包含2489UV、四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3 液相工作站）；Alltech ELSD 2000ES 型蒸發光檢測器、純水儀（法國Millipore 公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；TGL-16G 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ5200V 型超聲清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 柴胡皂苷c（批號：20191015）、柴胡皂苷a（批號：20190812）、柴胡皂苷d 對照品（批號：20190914），純度＞98%，均購自寶雞市辰光生物科技有限公司，氨水（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），水為去離子水。

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC）或“狹葉”柴胡（B.scorzonerifoliumWi11d）的干燥根莖（購自廣東康美藥業有限公司，批號20190418）。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水，梯度洗脫（表1），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為蒸發光散射檢測器（ELSD），進樣量為10 μL。

表1 HPLC 梯度洗脫條件

1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取柴胡藥材粉末（過2 目篩）1.0 g，置于150 mL 具塞錐形瓶中，加入體積比為10%的氨水-甲醇溶液25 mL，超聲提取45 min，過濾，用甲醇洗滌錐形瓶，在通風櫥中62 ℃水浴揮干，殘渣加甲醇溶解，定容于5 mL 容量瓶中。

1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷c、a、d 對照品9.52、10.14、15.28 mg，加甲醇適量使溶解，并定容至10 mL容量瓶中，得到含柴胡皂苷c、a、d分別為0.952、1.014、1.528 mg/mL 的混合對照品溶液。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

2.1.1 線性關系考察 精密吸取柴胡皂苷混合對照品溶液 2、5、8、10、12、15、20 μL 分別注入高效液相色譜儀，測定相應條件下的峰面積。以峰面積為縱坐標，以進樣量（μg）為橫坐標，制得標準曲線并計算相對應的回歸方程。精密吸取上述柴胡皂苷混合對照品稀釋液進樣，測定其信號（以峰高計算）與噪聲比值，將S/N=3 時的濃度定為檢測限（LOD），將S/N=10 時的濃度定為定量限（LOQ）。各組分在各自的含量范圍內線性關系良好，結果如表2 所示。

表2 線性方程及線性范圍

2.1.2 精密度試驗 精密稱取中藥柴胡粉末1.0 g，按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣，連續進行6 次，并計算柴胡皂苷a 面積的RSD（%）、柴胡皂苷c面積的RSD（%）、柴胡皂苷d面積的RSD（%）。結果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 的RSD分別為 1.27%、1.05% 和 0.58%，RSD均小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.1.3 穩定性試驗 分別于在 0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣，測定各供試品的峰面積。結果表明，柴胡中的柴胡皂苷a 峰面積的RSD為1.23%、柴胡皂苷c 峰面積的RSD為0.85%、柴胡皂苷d 峰面積的RSD為1.62%，均小于3.0%，說明供試品在24 h 內保持良好的穩定性。

2.1.4 重復性試驗 精密稱取6 份柴胡藥材粉末（過2 目篩）1.0 g，測定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d 的平均含量。結果表明，柴胡中柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的平均含量分別為0.954、0.982、1.826 mg/g；柴胡中柴胡皂苷 a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 含量的RSD分別為2.08%、2.42%、1.54%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取9 份柴胡藥材粉末0.5 g，分成低、中、高加樣組（0.5 g 藥材含量的80%、100%、120%加樣），每組分別加入混合對照品溶液（柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d），計算柴胡低、中、高加樣組中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 的平均回收率及其RSD。從表3 可以看出，該方法準確性良好。

表3 柴胡加樣回收率試驗結果（n=9）

2.1.6 專屬性試驗 精密吸取甲醇溶劑10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法進行測定，在測定時間內沒有色譜峰出現，說明甲醇溶劑不影響柴胡皂苷的測定，方法的專屬性良好，甲醇溶劑的色譜見圖1。

圖1 甲醇HPLC 色譜

精密吸取混合對照溶液1 mL，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，分別精密吸取5和10 μL。結果表明，柴胡皂苷c、a、d 的保留時間分別為7.4、17.8、29.1 min（圖 2）。

圖2 柴胡皂苷混合對照品HPLC 色譜

2.2 柴胡樣品含量測定

精密稱定3 份柴胡藥材粉末1.0 g 過2 目篩，按“1.2.1”項下的色譜條件以及流動相條件進樣，通過外標一點法計算柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量，結果見表4。

表4 柴胡樣品含量測定結果

3 小結

本研究建立的高效液相色譜法測定柴胡中柴胡皂苷c、a、d 的含量操作簡便、準確度高、精密度好，3種柴胡皂苷的色譜峰和試樣中其他組分的色譜峰可達基線分離，且分離度、峰型較好，可以作為柴胡皂苷c、a、d 的含量測定方法。