植物環核苷酸門控離子通道的研究進展

王欣悅，劉培源，余冰清，張艷峰，丁百香，嚴漢池

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

環核苷酸（CNMPs）是一類重要的信號分子，如3′，5′-環磷酸腺苷（cAMP）和 3′，5′-環磷酸鳥苷（cGMP）是動植物生命活動中信號通路的重要元件［1］。在動物中，細胞受外部信號刺激從而激活胞內嘌呤核苷酸環化酶（NCs），催化其底物核苷酸三磷酸合成CNMPs。胞內CNMPs 可由磷酸二酯酶（PDEs）代謝分解為非活性的單磷酸核苷［2］。動物中CNMPs 信號傳遞的主要分子開關有CNGCs 和超極化激活環核苷酸門控陽離子通道（HCNs）［3］。

植物中CNMPs是通過質譜分析法首次被發現［4］。研究證明，CNMPs 在調節植物發育和抵御脅迫反應中起重要作用，但其分子機制還需要進一步研究［5］。在植物蛋白質提取物中可檢測到PDE 活性［6］，但目前并不能通過基因水平證明植物中存在PDE 同系物。此外，盡管有一些研究表明植物中CNMPs 可以激活一些蛋白酶［3，7］，但仍缺乏生理生化分析，試驗存在爭議。還有猜測CNMPs 可作為基因啟動子中的特定調節元件［8］。目前，環核苷酸門控通道已被證實含CNMP 綁定結合域，是植物細胞CNMPs 調控的主要分子開關。已知存在兩類CNMP 綁定結合 域 ，即 GAF［9］（mammalian cGMP-binding PDEs，Anabaena adenylyl cyclases（ACs），E. coliFhlA）和環核苷酸結合域（CNMP-binding domain，CNBD）。研究表示，CNMP 綁定結合域可能不局限于GAFs 和CNBDs，通過對植物CNMP 相互作用組分析，發現了一種完全不同于已知的CNMP 綁定結合域的蛋白質組，說明植物CNMPs 可能調控下游多個信號通路，參與多種聯級反應［10］。目前，已知植物CNMPs 調節下游效應蛋白的有蛋白激酶、cAMP 激活的交換蛋白（EPAC）和環核苷酸門控離子通道（CNGCs）。其中，CNGCs 是主要的研究對象。CNGCs 是普遍存在植物細胞中非選擇性陽離子通道和分子開關，可將胞內環核苷酸信號轉導為節律性調控離子波動的信號以及調控細胞各種生理反應，參與植物的生長和發育過程，以及抵御各種脅迫反應。

在大麥糊粉層表達文庫中篩選鈣調蛋白（CaM）時，首次發現植物CNGCs家族基因［11］。隨后，在其他植物中也發現了CNGCs［12-15］，如擬南芥（Arabidopsist?haliana）、水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、梨（Pyrus bretschneideri）、抱子甘藍（Brassica oleracea）、小麥（Triticum aestivum）、棗樹（Ziziphus jujubaMill.）等。根據CNGCs 氨基酸序列相似度及功能可以分為多個亞家族。如擬南芥CNGC 家族根據系統發育關系被細分為5 個亞家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa 和Ⅳb）［16］。TaCNGCs 被分為 4 個亞家族Ⅰ～Ⅳ［17］。目前對于植物CNGCs 的基因組特征、系統發育比對研究較為清楚。隨著對植物CNGCs 的深入研究，其生理學作用及調控分子機制有了進展和突破，建立了CNGC 分子調控新模型［18-20］。

本研究從植物環核苷酸門控離子通道的分子結構特性、調節和離子選擇性以及功能進行了詳細綜述，總結植物環核苷酸門控離子通道在植物生長發育以及脅迫反應的新進展，對今后植物環核苷酸門控離子通道的研究方向進行展望，以期為植物環核苷酸門控離子通道研究提供參考。

1 植物CNGCs 的結構特征

植物CNGCs 與Shaker 型K+受體電壓門控通道結構相似，其N 末端和C 末端都在質膜內側，有6 個跨膜區（S1～S6），其中S4 為帶正電荷的跨膜區，在S5和S6 之間有參與離子門控的P 環。對梨和擬南芥CNGCs 結構的研究發現，S4 為電壓傳感器樣功能域并且在該基序中具有許多帶正電荷的殘基，表明植物的CNGCs 具有微弱的電壓傳感器功能。用電生理學分析驗證了CNGC 是電壓門控的離子通道［21］。P 環無規則卷曲的部分影響通道離子的選擇性和電導，這一點與對離子無選擇性的動物CNGCs 不同。植物CNGCs 的C 末端含有高度保守的CNBD，CNBD的 αC 螺旋即 CaMBD 可結合 CaM，而動物 CNGCs 的CaMBD 位于 N 端，二者不同［14，22］，如圖 1 所示。植物CNBD 序列不同于動物離子通道，包含綁定環核苷酸配體磷酸根和糖的磷酸鹽結合域（PBC），以及影響配體的選擇性和結合親和力的hinge 域［15］。CaMBD 位于 CNBD 的 C 端，二者重疊部分使 CaM 與CNMPs 競爭結合CNGC，從而引起通道蛋白的構象和狀態改變。研究發現AtCNGC20 與CaM 結合是通過獨特的異亮氨酸-谷氨酰胺即IQ 基序，且該基序與CNBD 的α-螺旋相鄰但不重疊［23］。經進一步的研究發現，AtCNGCs 家族部分成員也含有IQ 基序［11］。此外，AtCNGC11/12 的 IQ 位點域通道的功能緊密相關，當IQ 基序位點突變會破壞通道與CaM 結合，導致部分或全部通道功能喪失［24］。此外，位于核心IQ 序列N 端2 個丙氨酸殘基對結合CaM 起重要的決定作用。通過對20 個AtCNGCs 的IQ 序列酵母雙雜交（Y2H）分析，結果顯示只有部分IQ 序列與鈣調素保守結構域相互作用。IQ 基序的近端和遠端區域均不能與CaM 發生相互作用，這一發現表明CaM 的結合能力很可能取決于 IQ 基序位置［18］。

2 植物CNGCs 離子選擇與調節

CNGCs 是普遍存在植物體內的非選擇性陽離子通道。研究發現，多個AtCNGCs 與Ca2+滲透性緊密相關。通過異源表達系統發現AtCNGC2存在CNMP依賴性K+電流，對其他單價陽離子，如Li+、Cs+和Rb+也有滲透性［25］，在維持細胞外低濃度Ca2+水平中發揮重要作用［26］。沉默番茄SlCNGC1和SlCNGC14基因導致細胞內Ca2+顯著減少，表明SlCNGC1和SlCNGC14可能作為Ca2+通道發揮作用［27］。對大麥進行電生理分析，結果揭示HvCNGC2-3 通道是由Na+和K+同時存在而激活［28］。這種由2 種離子同時激活CNGC 通道的獨特性質鮮見報道［21］。

CNGCs 通 道活性 受 CNMP 和 CaM 與 CNGC 可逆結合發生變構反應調節。cAMP 可激活通道引發胞內 Ca2+濃度增加，CaM 與 CNGC 相互作用調控 Ca2+濃度［29］。Zhang 等［29］運用電生理學試驗發現，在非洲爪蟾卵母細胞異源表達系統中AtCNGC11/12 的活性不受CNMPs 影響，而與CaM 共表達時AtCNGC12通道活性顯著增強，AtCNGC11 則無明顯變化。結果表明，CaM 對CNGCs 通道活動和調節機制不同。研究表明，蘭尼堿受體2（Ryanodine receptor 2，RyR2）存在不同形式CaM 的分子識別特征及調節方式。CaM 和 Ca2+-CaM 結合 RyR1 中存在 2 個有重疊的結合位點，雙相調節RyR1 通道的活性［30］。植物CNGCs 存在 2 種 CaM 配體結合基序，即 CAmBD 和IQ CaM，不同的配體結合方式可能影響配體的調節功能。有研究提出，CaM 與 CNGCs 的 IQ 域 N 端結合并提供Ca2+依賴的反饋調控，從而精準地調節Ca2+信號［19］。此外，CNGCs 在不同組織和器官中可能以同源或異源聚體形式分別進行調控。Pan 等［19］研究證實CNGCs 和CaM 參與通道活動的調節和細胞中Ca2+濃度。CNGC8/CNGC7 與 CNGC18 形成的異源復合物通道與CaM2 結合，編碼植物花粉管發育中Ca2+波動信號和通道活性。Tian 等［20］通過蛋白激酶BIK1 可特異磷酸化AtCNGC2 和AtCNGC4 組成的異源復合物的3 個位點，從而解除CNGCs 通道抑制狀態通道，促進Ca2+內流，調控下游多個信號通路，為CNGC 的調節模式以及植物病理早期信號的感應提出了全新的作用范式。

3 植物CNGCs 生長發育功能

CNGCs廣泛存在于植物細胞并參與重要的生理過程。植物CNGCs作為陽離子通道參與多個生理過程，目前已知擬南芥CNGCs的功能如圖2所示［6］。

植物CNGCs 在生殖發育過程中的作用已經被廣泛研究，尤其是花粉管的生長和發育。梨PbrCNGCs 表達圖譜的分析顯示，PbrCNGC14-18（Ⅲ亞家族）、PbrCNGC2、PbrCNGC7-9（Ⅳ-B 亞家族）和PbrCNGC12 -13（Ⅰ亞家族）在花粉中特異表達［14］。已有研究表明，AtCNGC18 只在花粉粒中表達，AtCNGC7、AtCNGC8、AtCNGC16 僅在花粉發育過程中表達［31］。其中，AtCNGC18 在花粉管中的發育過程中起主導作用。在AtCNGC18 的CNBD 結構域點突變的植株中可觀察到花粉管生長發育障礙，仍可透過Ca2+，但減弱了CNMP 的激活作用。此外，AtCNGC18 在原核系統中的表達導致鈣離子濃度積累，可以推測花粉管生長機制可能與Ca2+相關，將CNMP 信號轉化為Ca2+流變化，說明AtCNGC18 可能是花粉管發育和頂端生長的主要Ca2+滲透通道［32］。另一個參與植物生長發育的Ca2+可滲透重要通道是AtCNGC2，參與植物開花調控、開花轉型，葉片衰老和葉片細胞鈣離子流入［26，33］。AtCNGC10 參與調節開花時間、葉表面擴張、下胚軸伸長、重力刺激和淀粉積累等過程［34］。在相同的溫度、光照和水的條件下，抗轉錄AtCNGC10 的開花時間比野生型植株提前10 d，其葉片積累淀粉含量幾乎是野生型植物的兩倍。目前已知AtCNGC10 可以在K+缺陷型大腸桿菌、低濃度K+酵母培養基中擴增，其抗轉錄植株K+含量低于野生型，推測AtCNGC10 在維持細胞內的K+平衡起重要作用［34］。關于植物的發芽和根生長目前只發現可能與AtCNGC3 相關。AtCNGC3缺失突變體在高鹽的環境下種子發芽數量減少，種子質量明顯下降［35］。擬南芥和水稻CNGCs 可能參與生長素依賴性調節，經生長素處理的擬南芥幼苗完全喪失 Ca2+以及酸堿度敏感性［36］。AtCNGC14缺失突變體與野生型植物的根相比，根生長和重力彎曲顯著延遲，根毛鈣信號異常，表明AtCNGC14 在調節根毛尖極性生長的過程中是必要的［37］。

對煙草CNGCs基因通過組織特異性表達模式分析發現，23個NtabCNGCs基因在不同的組織中差異表達，表明其在植物生長和發育中是不可或缺的。其中，NtabCNGC4在種子中表達水平最高，NtabCNGC32在幼葉中表達水平最高，NtabCNGC7主要在幼花中表達，NtabCNGC11在植物莖、根和成熟葉中表達水平最高［38］。在豆類植物中也有與CNGCs 相關的發現。對蒺藜狀苜蓿根中3 種可滲透鈣離子的CNGCs（MtCNGC15a/b/c）在根瘤菌和菌根共生體作用的研究中發現，這些通道可形成1 個具有鉀離子滲透性通道的復合物調節細胞核Ca2+的釋放［39］。

4 植物CNGCs 抵御脅迫功能

植物的生理反應與外部環境緊密相關，包括抵御生物和非生物脅迫。不同的脅迫反應會導致細胞CNMP 水平信號的發生特異性變化，CNMP 作為信號分子在調節不同抗逆生理過程中發揮重要作用。CNGCs 在抵御鹽脅迫過程中發揮重要作用，當土壤中高濃度鹽積累會導致植物根系難以吸收和利用水分，可能會引起植株體內的K+虧缺和NaCl 積累，對植物有一定的毒害作用［5］。研究發現，當擬南芥植物暴露于高濃度的鹽（NaCl）環境下，定位于根或芽中部分AtCNGCs 的轉錄水平增加。擬南芥幼苗中AtCNGC3 可能介導高鹽環境下Na+轉運，缺失AtCNGC3 的突變體會導致離子積累過少從而降低幼苗對高鹽的敏感性［35］。同樣的還有AtCNGC10 負調控擬南芥的耐鹽性，過表達AtCNGC10 表現對高鹽環境更加敏感，互補后恢復敏感性，其調節機制可能是AtCNGC10 在抵御鹽脅迫時可介導Na+的轉運［40］。此外，還有 AtCNGC19 和 AtCNGC20，當地上部分鹽濃度提高時表達上調，推測二者可能參與鹽脅迫引起的毒性效應［41］。在水稻耐鹽研究中發現，耐鹽性植株的OsCNGC1表達下調，說明OsCNGC1可能參與鹽敏感性反應［42］。通過基因芯片表達譜分析研究還發現，千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）幼苗中AhCNGC5 和AhCNGC17 參與對鹽脅迫的反應［43］。在鹽脅迫下，AhCNGC5表達上調，AhCNGC17下調。這些結果與AtCNGC5 和AtCNGC17 在擬南芥中的耐鹽性作用是一致［43，44］。

外環境中重金屬元素的積累會破壞植物細胞膜的通透性，在抵御金屬脅迫中，研究發現AtCNGC1缺失突變體可提高耐Pb2+性［45］。過表達煙草NtCBP4，增加了植物對Ni2+的耐受性和對Pb2+離子敏感。進一步的研究表明，與野生型相比，表達缺失CaMBD 和CNBD 的NtCBP4 截短體植株可提高對Pb2+的耐受性。研究鑒定并分析煙草根和葉組織在響應鎘脅迫的NtabCNGCs基因表達譜，結果表明，18 個NtabCNGCs表達上調［38］。NtabCNGC6和NtabCNGC7分別在葉和根中顯著表達。為研究煙草耐鎘的分子機制，對其miRNA 表達譜進行分析，發現nta-miR482d 的目標基因是CNGCs。在鎘脅迫下，鎘敏感植株nta-miR482d 表達上調。表明miR?NA 在調節鎘耐受反應中可能發揮了重要作用［46］。Moon 等［47］對擬南芥幼根 CNGCs 響應重金屬離子的反應進行研究，結果表明，AtCNGC1、AtCNGC10、AtCNGC13 和 AtCNGC19 在 Pb2+毒性中起作用，而AtCNGC11、AtCNGC13、AtCNGC16 和 AtCNGC20 在Cd2+毒性中起作用。此外，AtCNGC1和AtCNGC13基因突變體體內Pb2+積累減少，AtCNGC11、AtCNGC15和AtCNGC19基因突變體植物中Pb2+和Cd2+積累均減少。這些發現確定了特定的CNGC基因在植物重金屬脅迫響應中的功能。

干旱是降低植物吸收和利用水分、影響正常生長發育的主要因素植物。Singh 等［48］年對扁豆（Lens culinaris medikus）家族的轉錄組分析發現該家族的CNGCs 可能參與調節干旱脅迫耐受性，在不利環境下部分基因下調。Nawaz 等［38］通過反轉錄-定量聚合酶鏈（RT-qPCR）反應分析煙草CNGCs 發現，NtabCNGC1、3～7、14、16、17、26～28和30～33在干旱脅迫條件下基因表達水平有顯著變化。多數NtabCNGCs表達從第2 天開始逐漸增加，在第8 天達到高峰。在第 8 天時NtabCNGC1、6、7、28表達水平較高。表明NtabCNGCs可能參與了干旱的后期反應。

植物對熱脅迫的早期響應主要是通過調節Ca2+實現的。編碼水稻16 個CNGCs，在寒冷環境下10個CNGCs 表達上調。AtCNGC6 在熱應激條件下可以誘導Ca2+內流，促進熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）基因的表達。隨著熱脅迫的發展，cAMP 含量增加，激活AtCNGC 通道并進一步促進HSP參與熱脅迫反應［49］。缺失 AtCNGC16 的突變體抑制HSP基因的表達。AtCNGC2 和 AtCNGC4 功能的紊亂使HSP表達閾值降低；小立碗蘚中與AtCNGC2同源基因CNGCb，其缺失突變體表型與AtCNGC2 的缺失突變體表型相同均為對熱敏感，說明其參與植物的耐熱反應［50］。Katano 等［51］對AtCNGC2 和AtCNGC4 的研究進一步說明，其可能參與植物的熱脅迫響應。研究發現，擬南芥AtCNGC2 2 種基因缺陷型（AtCNGC2-1 和 AtCNGC2-2）幼苗，在持續3 h 熱脅迫下與野生型植物相比表現出更強的耐受性。結果證明，缺失AtCNGC2 可以增強擬南芥幼苗對熱脅迫的耐受性。為探究AtCNGC2 缺失對熱反應的信號通路，對各種熱效應蛋白進行累積分析，試驗發現AtCNGC2-1 和AtCNGC2-2 植株幼苗積累較多的熱效應蛋白，而在花或葉中的熱效應蛋白與野生型植物相當或低于野生型植物。Thoen等［52］研究發現，AtCNGC4 可能是響應熱脅迫中超敏反應HR 信號通路中的一部分。AtCNGC4 在寒冷應激中表達下調，在熱應激下表達上調。Kakar 等［15］研究發現，抱子甘藍的CNGCs 家族有26 個基因。通過RT-qPCR 分析其在不同條件下轉錄水平，結果表明，BoCNGCs基因對寒脅迫敏感。26 個BoCNGCs基因中在 4 ℃孵育 24 h 后，其中 13 個BoCNGCs表達上調。其亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ基因表達水平與冷應激顯著相關，其中BoCNGC17和BoCNGC23表達水平最高，而亞家族Ⅲ基因與對照組無明顯差別或略低于對照組。棗樹中ZjCNGC2和ZjCNGC4在寒脅迫下顯著下調［53］。Nawaz 等［38］研究發現，10 個NtabCNGCs在冷脅迫下（4 ℃持續1、2 d）基因上調。與對照組相比，NtabCNGC6和NtabCNGC7轉錄水平最高。芒果參與抗寒脅迫反應中MiCNGC15Ⅱ轉錄水平分別在第二天、第七天和第十四天后表達上調。植物抗寒脅迫反應可能是由CNGCs 調節的鈣信號引起級聯反應［54］。

在抵御病原體脅迫的過程中，目前報道參與擬南芥植物病原微生物免疫反應響應的有4個基因［55］，即AtCNGC2、AtCNGC4、AtCNGC11和AtCNGC12。最新研究通過非洲爪蟾卵母細胞表達系統和雙電極電壓鉗試驗揭示了AtCNGC2、AtCNGC4在免疫響應早期應答形成的關鍵鈣離子通道復合物及其活性調控機制［20］。當AtCNGC2或AtCNGC4單獨表達時都不能形成鈣離子活性通道；但當二者同時表達時，可形成鈣離子活性的通道，暗示植物體內AtCNGC2和AtCNGC4可能相互作用形成鈣離子通道。進一步研究發現，鈣調蛋白作為門控分子與AtCNGC2-AtCNGC4通道相結合，使通道保持關閉狀態；在病原體侵染時，宿主細胞通過PRRs 感知PAMPs，導致細胞內Ca2+濃度的增加，CNGC2-CNGC4-CaM 復合物被PTI信號通路上游的類受體胞質激酶BIK1 特異性磷酸化從而激活通道，介導胞外Ca2+內流，啟動下游Ca2+依賴的PTI 免疫反應。這一試驗進一步證實，植物CNGCs家族可能以復合體發揮作用，同時揭示了植物一種新的鈣信號編碼的分子機制［20］。對菜豆的研究發現，當土壤中存在立枯絲核菌時PvCNGC2轉錄上調，經過木霉處理后下調。推測PvCNGC2參與病原防御相關反應［56］。沉默小麥TaCNGC14和TaCNGC16基因可降低HR 反應并增加植物的抗性［17］。在向日葵（Helianthus annuus）黃萎病菌抗性植株中發現，某些CNGCs 的表達水平顯著提高，這表明CNGCs 可能參與 HR 反應［57］。Kakar 等［15］研究發現，黃單胞菌病原體（Xanthomonas campestrispv. Campestris，Xcc）引起BoCNGCs 第Ⅰ、Ⅱ亞家族中 10 個BoCNGs表達上調，與植物抗寒脅迫的 CNGCs 結果一致。Zhang 等［27］用轉錄組學分析蘋果響應楊樹潰瘍病（Botryosphaeria dothidea）的過程，其中與AtCNGCs第Ⅰ亞家族同源基因MdCNGC1顯著上調，表明在植物對病原體的防御過程可能起負調節作用。Nawaz 等［38］在煙葉中的表達并接種黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y 病毒［Potato virusY（PVY）］、BSD 病毒（Phytophthoranicotianae，BSD）3 種不同的病毒，發現3 種病毒均引起NtabCNGCs表達水平顯著變化。BSD 處理的植物中，19 個NtabCNGCs基因的表達上調，其中大多數基因顯示較晚響應，表達水平顯著升高的是NtabCNGC31。CMV病毒誘導23個NtabCNGCs顯著上調，第一、第四亞家族基因轉錄水平波動明顯，其中NtabCNGC29的表達最高。在PVY 試驗中，少數第一、第四亞家族基因顯著應激表達，其中NtabCNGC2響應最早，NtabCNGC33響應最晚。

5 展望

植物細胞中CNGCs 作為CNMPs 的重要受體之一，引起人們的廣泛關注和研究。目前，對植物CNGC 的研究取得了一定的進展，研究的焦點主要是CNGCs基因鑒定與分組、CNGCs的結構域等。植物基因組分析顯示，植物CNGCs 相較于動物是一個龐大的家族，且植物和動物的CNGCs是分開進化的，暗示植物CNGCs 的功能及分子機制可能不同于動物。隨著細胞電生理技術、植物基因組測序和基因組研究方法的發展，推進了CNGCs基因的鑒定、離子通道選擇性和信號轉導途徑中生理功能的研究，有望闡明CNGC 功能作用的分子機制。但目前關于植物CNGCs 的精準功能作用及分子機制的研究還相對滯后，為進一步的研究和證實CNGC 的功能，可以嘗試進一步探索CNGCs 在不同類型植物中的亞細胞定位以及作用，如利用功能缺陷性突變體來確定CNGC 的作用及可能的分子機制。

此外，需要確定CNGC 的工作模式。動物中CNGC 以異源四聚體的形式發揮作用，推測植物CNGCs 也是通過這種機制發揮作用，比如現研究發現AtCNGC7/8 與AtCNGC18 可能會形成異源四聚體發揮作用，同時有研究表明AtCNGC7、AtCNGC8 與AtCNGC18 的表型一致且均屬于第三亞家族。AtCNGC2 與AtCNGC4 可能以異源四聚體形式編碼Ca2+信號波動參與植物細胞免疫反應，同時有報道AtCNGC2 和AtCNGC4 突變體具有免疫異常表型且CNGC2 與CNGC4 同屬Ⅳ-B 亞家族。那么，在今后的研究中有必要探索表型一致或同一分組是否可以通過組裝多聚體來發揮作用，比如AtCNGC19/20、OsCNGC12/13 等。除上述外，在植物中各類信號分子是如何動態調節CNGCs 這一分子開關，以及如何調控分子或蛋白的信息傳遞是今后研究的重點。