氣滯胃痛丸中間體指紋圖譜研究

臧玉豹 馬子君

江蘇省新沂市中醫醫院藥劑科，江蘇新沂 221400

新沂市中醫醫院（我院）氣滯胃痛丸是中醫辨證論治理論指導下，經多年臨床配伍篩選、提取和制劑研究而成的，目前處于備案前期研究階段。醫療機構制劑在中國有著悠久的歷史，隨著中國制藥工業的發展，從小到大，從無序到有序，積累了豐富的經驗，形成了固有的特色。醫療機構制劑在醫療、科研、新藥研發等方面發揮著重要的作用。我院院內制劑氣滯胃痛丸由柴胡、香附等5味中藥組方而成，具有疏肝理氣、和絡調中的作用。氣滯胃痛丸是以名老中醫臨床應用多年的經驗方為基礎，在醫院臨床應用湯劑有明顯療效的基礎上，對復方制劑進行了工藝和劑型上的研究[1-2]，是一種將傳統中藥經驗、理論與現代中藥技術緊密結合，具有標本兼治、防治的中藥復方制劑，目前已完成生產工藝及鑒別分析研究，正開展氣滯胃痛丸院內制劑質量標準體系研究[3-5]。本文針對該中藥制劑中間體開展指紋圖譜研究，以評價不同批次的氣滯胃痛丸中間體質量，建立氣滯胃痛丸院內制劑質量標準體系，同時為其醫療機構制劑備案提供理論依據[6-7]。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

10批次氣滯胃痛丸中間體（未成丸前制劑中間體），由新沂市中醫醫院提供。

1.2 試劑

乙腈（色譜級，Fisher）；甲醇（色譜級，Fisher）；水（娃哈哈純凈水）；分析乙醇（北京化工廠）；磷酸（北京化工廠），甲酸（色譜級，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

高效液相色譜儀（戴安Ultimate3000）；C18色譜柱 HypersilODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；萬分之一電子天平（梅特勒ME204E）；十萬分之一天平（梅特勒AB135-S）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 不同色譜柱考察[8-10]不同色譜柱柱溫與流速對色譜行為有影響。柱溫的選擇，本實驗分別選擇 25 ℃、30 ℃、35 ℃，依次考察，結果發現色譜柱在30 ℃下，色譜行為最佳。流速本實驗分別選擇 0.8、1.0、1.2 ml/min，依次考察，結果發現流速在1 ml/min下，色譜行為最佳。

2.1.2 提取方式考察 本實驗設定提取方式為超聲和回流兩種方法，固定提取溶劑、提取時間，根據色譜圖結果可知超聲和回流提取所得到的成分差不多，回流提取操作較復雜，故選定超聲提取，不僅提取方便，提取率高。

2.1.3 提取溶劑考察 根據化學成分的極性大小，選擇合適的溶劑將有效成分提取完全。本實驗設定溶劑為不同濃度甲醇、乙醇，分別是30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇依次考察，結果發現80%甲醇提取成分完全，色譜峰最多，提取率高，色譜峰分離最佳。

2.1.4 提取時間考察 本實驗對超聲提取時間進行考察，依次設定 30、40、50、60 min。結果發現超聲提取30 min時氣滯胃痛丸中間體成分提取完全。

2.1.5 粒度考察 中間體的粉碎程度對有效成分的提取率有影響，本實驗將中間體粉碎依次過20、40、60、80目，對不同藥材粒度進行考察。結果發現粒度在40目是有效提取率最大，而80目有效成分提取率降低，提示不是藥材粒度越小，提取得到有效成分的含量越高，藥材粉碎過細，可能導致組織破壞，有效成分反而降低。

2.1.6 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g中間體粉末（過40目篩），加入80%甲醇25 ml，稱定重量，超聲提?。?200 W，50 kHz）30 min，靜置室溫，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，0.45 μm濾膜過濾即得。

2.2 色譜條件確立[2-7]

本實驗對檢測波長、流動相組成、梯度、流速、柱溫等進行考察，最終確定最佳的色譜條件。色譜柱：HypersilODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.1%磷酸；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min進樣體積10 μl，色譜梯度見表1。

表1 色譜條件梯度表

2.3 專屬性考察

取80%甲醇空白溶劑及供試品溶液依次進樣，記錄色譜圖。結果空白溶劑對樣品溶液無影響，表明該方法專屬性良好（圖1～2）。

圖1 空白溶劑

圖2 供試品溶液

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度 取一份供試品溶液，按照上面的色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖，以3號峰為參照物，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別0.03%～0.22%、0.63%～2.84%，均小于3%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性 稱取同一批號供試品溶液，按照供試品處理方法，制備6份供試品溶液，按照上面的色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，以3號峰為參照物，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.04%～0.20%、0.72%～2.79%，均小于3%。

2.4.3 穩定性 取一份供試品溶液，室溫環境下放置一段時間，分別在 0、2、4、6、8、12、24 h 后，按照上面的色譜條件，依次進樣，記錄色譜圖，以3號峰為參照物，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.07%～0.44%，0.54%～1.04%，均小于3%。表明方法穩定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

精密吸取按2.1項下方法制備的10批次供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，按照供試品處理方法制備供試品溶液，依據確定的色譜條件依次進行測定，記錄色譜圖，并將10批中間體色譜圖譜依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價統”（2004A版）軟件，進行相似度評價，見圖3。

設S1色譜圖為參照譜，生成中間體對照指紋圖譜，見圖4。本實驗按照共有峰的標定要求，根據10批供試品色譜圖，篩選確定共有峰8個。并計算10批次中間體的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.02%～0.15%，0.26%～1.96%。

圖3 10批次中間體指紋圖譜疊加

圖4 對照指紋圖譜

2.6 相似度評價

10批中間體指紋圖譜相似度均大于0.9，相似性良好，說明中間體質量均一、穩定。見表2。

表2 10批次中間體相似度

3 討論

隨著中藥的不斷發展，指紋圖譜技術被廣泛的應用于中藥質量綜合評價及質量控制。中藥指紋圖譜是對中藥進行加工處理，采用現代分析方法而得到標示該中藥化學信息的相關譜圖。其反映中藥成分的相對關系，可用來鑒別中藥真實性或評價制劑質量及監測多類成分變化等，是一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別手段。其具有特征性、整體性和模糊性等特點。近幾年對中藥指紋圖譜技術的研究主要應用于中藥質量標準體系、建立中藥制劑生產過程數字化指紋圖譜質量控制體系等[11-12]。

氣滯胃痛丸由柴胡、香附等5味中藥組方而成，各味中藥產地以及每批次制劑均有不同，其具有特征性、整體性和模糊性等特點，使用單一成分含量測定對其進行質量控制并不夠全面，中藥指紋圖譜技術剛好可以彌補這樣的不足，給予多成分質量控制，以便建立氣滯胃痛丸指紋圖譜質量控制體系[13-15]。

本研究采用高效液相色譜法確定了中間體的色譜條件及供試品提取方法，建立了中間體指紋圖譜，并進行了方法學考察，方法穩定，重現性良好，篩選確定共有峰8個，色譜行為良好，可用于醫院內部質量控制及評價中間體質量，但由于條件受限，未對各味中藥進行峰歸屬鑒定，未來將進一步提高該品種指紋圖譜研究。