鹽酸奧普力農(nóng)注射液細菌內毒素檢查方法的研究

焉媛媛 趙志龍 林 鵬 王秀英

遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧沈陽 110036

急性心力衰竭又稱急性心功能不全，是由于心排血量短期內急劇下降所導致的疾病。多見于血壓突然升高時、急性心肌炎、急性心肌梗死等急性心肌彌漫性損害時；瓣膜嚴重狹窄、心室流出道梗阻導致急性機械性阻塞心臟排血受阻時；心室顫動、顯著心動過速等導致致命性心律失常時；由于上述原因引起急性心力衰竭的發(fā)生。鹽酸奧普力農(nóng)是日本株式會社開發(fā)研制的用于治療急性心力衰竭的藥物，化學名為1，2-二氫-5-咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基-6-甲基-2-氧代-3-吡啶碳氰鹽酸鹽一水合物，分子式C14H10N40·HCl·H20，鹽酸奧普力農(nóng)選擇性地阻礙環(huán)磷腺苷的特異的磷酸二酯酶（PDE），具有增強心收縮力和擴張血管的作用。鹽酸奧普力農(nóng)于1982年開始研究，1986年開始臨床，1996年在日本正式上市，證明對急性心力衰竭有明顯治療效果。鹽酸奧普力農(nóng)不僅可以增加心肌的耗氧量，還增加心肌輸出量，比兒茶酚胺改善心肌能量有效率高，主要應用于其他藥物療效不佳的急性心力衰竭的短期靜脈治療，臨床上廣泛應用。鑒于鹽酸奧普力農(nóng)注射液的這些優(yōu)勢，本文對此進行研究，以控制產(chǎn)品質量。

1 材料

1.1 受試物

鹽酸奧普力農(nóng)注射液（沈陽雙鼎制藥有限公司，批號 S181101，規(guī)格：5 ml∶ 5 mg）。

1.2 鱟試劑

湛江博康海洋生物有限公司，批號1801082，規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度0.125 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號1809032，規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度0.125 EU/ml。

1.3 細菌內毒素檢查用水

廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號18016003，規(guī)格：5 ml/支。

1.4 細菌內毒素工作標準品

批號150601-201885，效價80 EU/支，中國食品藥品檢定研究院。

1.5 儀器設備

電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號XSE204，設備編號B64940782；內毒素凝膠法測定儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司，型號ET-96，出廠編號 05-23-17。

1.6 實驗條件

保溫溫度（37±1） ℃。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復核

按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1143“細菌內毒素檢查法”進行檢查。在規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內毒素的最低濃度即鱟試劑的標示靈敏度。當新購的鱟試劑使用新批號時或條件發(fā)生變化而影響到實驗結果時，都應進行鱟試劑靈敏度復核[3-4，6，9-10]，以確保產(chǎn)品質量符合實驗要求。具體操作先將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個濃度，每個濃度做4管，加樣后用封口膜封好，輕輕混勻，（37±1）℃保溫1 h。結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度標定結果

結果表明，最大濃度2λ各管均為陽性，最低濃度0.25λ各管均為陰性，陰性對照是陰性，本次實驗成立。所選用兩個廠家的鱟試劑標示靈敏度均在0.5λ～2λ之間，表明鱟試劑靈敏度符合規(guī)定，可以用于實驗。

2.2 細菌內毒素限值的確定

根據(jù)本品的臨床用法用量，參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部[2]通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”進行細菌內毒素限值的確定，并求得最大無干擾濃度。

限值計算公式[7-8，11]為：L=K/M，M為人用每千克體重每小時最大劑量，本品臨床用量為：0.01 mg/kg+0.0004 mg/（kg·h）×55=0.032 mg/（kg·h）。K 為人用每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5EU/（kg·h）。計算本品限值為：L=K/M=5 EU/（kg·h）/0.032 mg/（kg·h）=156 EU/mg。

經(jīng)計算本品理論限值為156 EU/mg，本品擬定申報限值為50 EU/mg，約為計算限值的1/3，限值設置合理。擬定本品內毒素限值為每1 mg鹽酸奧普力農(nóng)中含內毒素的量應小于50 EU。

2.3 干擾實驗預實驗

本次進行干擾實驗預實驗的目的是，找出供試品溶液中未檢出內毒素并且不超過最大有效稀釋倍數(shù)的溶液，以確定本次供試品溶液的濃度。本次選擇供試品溶液為0.0025～0.0800 mg/ml 6個系列濃度，陰性對照為細菌內毒素檢查用水，陽性對照為2λ內毒素溶液，供試品陽性對照為供試品溶液稀釋的2λ內毒素溶液，加完樣品后操作同鱟試劑靈敏度復核。見表2。結果表明，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對細菌內毒素檢查符合規(guī)定，0.04 mg/ml濃度以下對樣品無干擾。

2.4 正式干擾實驗

根據(jù)干擾實驗預實驗的結果，確定使用供試品溶液的最終濃度為0.04 mg/ml。所用的鱟試劑同鱟試劑靈敏度復核，靈敏度均為0.125 EU/ml。本實驗分為兩組：一是檢查用水組將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個濃度，二是供試品組用鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度的溶液將細菌內毒素工作標準品也稀釋至相同的4個濃度，加完樣品后操作同鱟試劑靈敏度復核。見表3。

表2 鹽酸奧普力農(nóng)注射液干擾實驗預實驗結果

表3 鹽酸奧普力農(nóng)注射液干擾實驗結果

結果表明，用兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑進行干擾實驗，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對細菌內毒素檢查無干擾。

2.5 細菌內毒素檢查實驗[1，15]

根據(jù)擬定限值計算：C=λ/L=0.125 EU/ml/50 EU/mg=0.0025 mg/ml

按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部[1]通則1143“細菌內毒素檢查法”進行。所用的鱟試劑同鱟試劑靈敏度復核，供試品濃度為0.0025 mg/ml溶液，陰性對照為細菌內毒素檢查用水，陽性對照為2λ內毒素溶液，供試品陽性對照為供試液溶液稀釋的2λ內毒素溶液。見表4。結果表明，按照擬定標準檢驗，對1批鹽酸奧普力農(nóng)注射液進行細菌內毒素檢查，結果符合規(guī)定。

3 結論

在本實驗室條件下，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對細菌內毒素檢查無干擾，并對1批樣品按擬定的細菌內毒素限值進行檢查，結果符合規(guī)定。

4 討論

4.1 鹽酸奧普力農(nóng)注射液結果確定

從實驗結果看，鹽酸奧普力農(nóng)注射液對鱟試劑與細菌內毒素之間的反應無干擾作用，限值設置合理，其細菌內毒素檢查法可行，可以控制產(chǎn)品質量，以確保臨床用藥安全。

4.2 兩種實驗方法的比較

細菌內毒素檢查法和傳統(tǒng)熱原檢查法的比較[5，12，16-17]，細菌內毒素檢查法是用鱟試劑做實驗，其靈敏度高，準確性強，操作方便，受客觀影響因素較少；熱原檢查法，需要用家兔做實驗，動物成本高，誤差大，受客觀影響因素較多?，F(xiàn)在已經(jīng)有越來越多的藥品施行細菌內毒素檢查法。

4.3 鹽酸奧普力農(nóng)注射液藥理作用及臨床禁忌證

鹽酸奧普力農(nóng)注射液藥理和毒理作用[13-14]是：鹽酸奧普力農(nóng)是一種PDE的Ⅲ抑制劑，具有正性肌力作用和血管擴張作用，主要通過抑制PDE，使心肌細胞內環(huán)境的磷酸腺苷（cAMP）濃度提高，細胞內鈣數(shù)量增多，心肌收縮力增強，心肌排血量增加。在臨床上起到很好的治療效果。其藥理作用還有：①奧普力農(nóng)可以保護心臟，健康成年人靜脈給予1.25～50.00 μg/kg鹽酸奧普力農(nóng)藥動學呈線性變化，給藥劑量與血藥濃度之間基本上成比例關系，能起到很好地保護心臟的作用。②擴張血管，給予鹽酸奧普力農(nóng)后腦血流、心輸出量明顯增加，提示鹽酸奧普力農(nóng)具有明顯擴張腦血管的作用?？梢娫撍幬镞€具有增加腦代謝的作用，未來可以作為新藥研究用于治療腦血管痙攣引起的偏頭痛等癥狀。③對于呼吸系統(tǒng)的影響，能擴張支氣管，增加cAMP產(chǎn)生支氣管擴張作用，緩解支氣管平滑肌痙攣，起到治療支氣管哮喘的作用。④抗炎作用，冠狀動脈搭橋術后給予鹽酸奧普力農(nóng)，具有促炎作用，使抗炎作用經(jīng)體外循環(huán)后達到高峰，說明該藥物具有一定的抗炎作用。⑤器官保護作用，減輕或消除缺血-再灌注損傷（IRI）是近些年來臨床面臨的重大研究課題之一。通過減少細胞因子表達，減輕炎癥程度，從而起到對損傷器官的保護作用。然而事物都具有相對的兩個方面，有好的方面，同樣也有不利因素存在。鹽酸奧普力農(nóng)注射液對于肥厚型梗阻性心肌病患者禁用，使用后會加重狹窄影響心肌輸出量，使病情進一步加重。下列情況疾病也要謹慎使用，如嚴重的快速型心律失?；颊?、腎功能受損患者和嚴重的低血壓患者，使用本品后會引起原有的疾病加重，提示上述這些疾病臨床上慎重使用。

4.4 鹽酸奧普力農(nóng)注射液今后的發(fā)展前景

隨著心、腦血管病診療技術的不斷提高，許多在急性期死亡率極高的疾病如急性心肌梗塞，由于采用了擴張血容量和溶栓等治療手段，使死亡率明顯降低，可是由此引起心力衰竭的發(fā)病率確在逐年增多。還有隨著人類壽命不斷地延長，心肌老化也已經(jīng)成為引起心力衰竭發(fā)生的重要原因。心衰已成為21世紀人類面臨的最難以攻克的頑固性疾病之一。當臨床上出現(xiàn)心力衰竭癥狀時，必將是冠心病、高血壓、腦梗引起死亡的最后致命癥狀，隨時都有生命危險，心衰的死亡率非常之高，有統(tǒng)計結果[14]表明，重度心衰患者死亡率高達50%，心衰患者得病2年后死亡率高達30%～40%，患病時間越長，復發(fā)的幾率就越高，就需要反復住院治療，這樣周而復始，嚴重影響患者的生命質量和生活質量。根據(jù)2000—2001年亞洲心血管病國際合作研究中國部分的研究結果顯示我國心力衰竭患者已高達400萬。而國內藥品能治療心力衰竭的品種尤其甚少，只有魯南制藥廠生產(chǎn)的米力農(nóng)注射液一個品種，遠遠滿足不了市場的需求，這也是本文著手研究制定注射劑安全性標準的目的所在，早研究早出結果，早點解除患者的痛苦。

表4 細菌內毒素檢查結果

由此可見鹽酸奧普力農(nóng)注射液上市后，能緩解市場供需緊張的問題，會有很好的市場前景和發(fā)展空間。