基于血清拉曼光譜技術對丙型肝炎病毒診斷和6a亞型的鑒別

陳 翀 黃杰庭

1.廣州血液中心 廣州市血液安全重點實驗室質量控制部，廣東廣州 510095；2.廣州血液中心 廣州市血液安全重點實驗室輸血研究所，廣東廣州 510095

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染已成為全球性問題，約有1.7 億感染者，其中中國感染者有一千多萬[1-2]。HCV 感染早期病情隱匿，無典型癥狀，55%～85%未發現被感染而轉變為慢性HCV，若不及時予以合理治療，HCV 會加速肝纖維化，增加肝硬化的風險，一旦發展為肝硬化，則每年有1%～5%會發展至肝癌[3-5]。因此，HCV 早期篩查和分型，對預防HCV 傳播和提高HCV 治療效果有重要的臨床意義[6]。本研究應用拉曼光譜（raman spectrum，RS）技術分析HCV 及健康人的血清，并評價其對HCV 診斷和6a 亞型鑒別的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究對象來源于廣州血液中心，HCV 組共165 例，均為2018 年1 月至2019 年6 月在血液中心確診HCV 感染患者，納入標準：①符合HCV 的診斷標準[7]；②初篩血清HCV 抗體陽性；③血清RT-PCR 法完成HCV DNA 定量檢測，其載量＞最低檢測限（5×102），證實為HCV 感染。排除標準：①HBV、梅毒、HIV 等感染；②其他特殊全身性疾病；③近期急性感染；④免疫系統疾病；⑤標本不合格。另選擇本中心同期無償獻血體檢健康者120 例（所有檢查項目未見異常者）為非HCV 組。本研究遵循《世界醫學會赫爾辛基宣言》，入選對象均簽署知情同意書。HCV 組年齡23 ～75 歲，平均（47.53±8.51）歲；男91 例，女74 例；基因分型：1b 87 例，3b 39 例，6a 19 例，其 他20 例。非HCV組年齡22 ～72 歲，平均（46.91±7.82）歲；男68 例，女52 例。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集兩組受試者空腹（禁食過夜8 h 以上）靜脈血5 ml，室溫靜置0.5 h 后離心（3000 r/min）10 min，上層血清分裝收集到EP 管中，-80℃冰箱保存待測。檢測時將待測樣本置于室溫下靜置0.5 h 讓其充分溶解，吸取血清30 μl，靜置15 min，待樣本狀態穩定后再進行檢測，所有樣本都統一進行上述預處理。

1.2.2 檢測方法 使用DXR3 激光RS 儀（賽默飛公司），最低波數10 cm-1，光譜范圍50 ～9000 cm-1，光譜分辨率≤0.35 cm-1，配備共焦顯微鏡，在50 倍鏡下觀察記錄RS。每次檢測開始前，在532 nm 激光下用質控品觀察300 ～3000 cm-1位移范圍內的RS 數據，儀器校準后再開始樣本檢測。參數設置：激光波長532 nm，光譜分辨率5 cm-1，拉曼位移范圍300 ～3000 cm-1，掃描時間1.0 s。每份樣本在不同位置分別檢測3 次，所得圖譜用Spectrum Analyzer 檢測軟件進行光譜記錄分析。

1.3 觀察指標

觀察記錄RS 診斷HCV 的結果和6a 亞型的鑒別結果。

1.4 統計學方法

采用Spectrum Analyzer 和Matlab 軟件進行數據分析，應用自適應迭代重加權懲罰最小二乘法（airPLS）扣除所得光譜圖的熒光背景，應用偏最小二乘法（PLS）進行模型構建和支持向量機分類法（SVM）判別分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，應用受試者工作特征（ROC）曲線評價airPLS-PLS-SVM 統計模型的診斷效果，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RS診斷HCV的結果

圖1a、b、c 中虛線為HCV 組165 個樣本的平均譜圖，實線為非HCV 組120 個正常樣本的平均譜圖；圖1a 使用airPLS 扣除所得光譜圖的熒光背景后得到圖1b，可見airPLS 扣除熒光背景前存在較大噪聲干擾，這一操作是非常有必要的。進一步的數據分析比對得到圖1c，可見在HCV 組與非HCV組300 ～3000 cm-1位移范圍內的血清RS 圖像形態相似，但部分位移處仍存在差異。

圖1 HCV 組與非HCV 組拉曼數據的平均譜圖

使用PLS 對扣除熒光背景后的數據進行降維、簡化處理，提取9 個主成分，獲得9 個（PLS-1 ～PLS-9）主成分繪制的散點圖，見圖2a、b、c，菱形為非HCV 組9 個主成分，圓形為HCV 組9 個主成分。由圖2a、b、c 可見，HCV 組與非HCV9 個主成分在三維空間上存在部分重疊，但可區分開，這一點說明RS 技術能將HCV 患者血清與正常健康人血清區分開。

圖2 HCV 組與非HCV 組PLS-1 ～PLS-9 散點圖

應用SVM 對降維后的9 個主成分數據進行判別分析，采用簡單隨機抽樣法將所有研究對象分組，大概按4 ∶3 的比例，其中訓練集285 例（HCV 165 例，健康120 例），測試集122 例（HCV 70 例，健康52 例）。使用網格尋優法對SVM 中的參數懲罰因子（c）、核函數（g）進行尋優，所獲結果見圖3a，可見HCV 組與非HCV 組血清光譜數據被很好的區分開。應用ROC曲線評估airPLS-PLS-SVM 統計模型對測試集122 例血清的診斷效果，測試集中經RT-PCR 有70 例 確診為HCV，非HCV 感染者52 例；本統計模型診斷正確陽性66 例，診斷正確陰性52 例，見表1，靈敏度為94.29%，特異度為96.15%，準確率為95.08%，ROC曲線見圖3b，曲線下面積（AUC）為0.953。

表1 RSairPLS-PLS-SVM統計模型診斷HCV的結果

圖3 3D 圖及ROC 曲線圖

2.2 6a亞型的鑒別分析

使用Matlab 軟件對19 例6a 及146 例其他型HCV 患者的原始數據進行繪圖，圖4a 使用airPLS扣除所得光譜圖的熒光背景后得到圖4b，虛線為6a 亞型19 個樣本的平均譜圖，實線為146 個其他亞型樣本的平均譜圖，可見airPLS 扣除熒光背景前存在較大噪聲干擾，這一操作是非常有必要的。進一步的數據分析比對得到圖4c，可見在6a 亞型與其他亞型300 ～3000 cm-1位移范圍內的血清RS圖像形態相似，但部分位移處仍存在差異。

圖4 6a 亞型和其他型HCVRS 的平均譜圖

使用PLS 對扣除熒光背景后的數據進行降維、簡化處理，提取6 個主成分，獲得6 個（PLS-1 ～PLS-6）主成分繪制的散點圖，見圖5a、b，菱形為6a 亞型6 個主成分，圓形為其他亞型6 個主成分。由圖5a、b 可見6a 亞型與其他型6 個主成分在三維空間上存在部分重疊，但可區分開，這一點說明RS 技術能將6a 亞型患者血清與其他型患者血清區分開。

應用SVM 對降維后的6 個主成分數據進行判別分析，采用簡單隨機抽樣法將所有HCV 患者分組，其中訓練集165 例（6a 19 例，其他146 例），測試集71 例（6a 9 例，其他62 例）。使用網格尋優法對SVM 中的參數懲罰因子（c）、核函數（g）進行尋優，所獲等高線圖見圖5c，可見6a 亞型與其他型血清光譜數據被很好的區分開。應用ROC 曲線評估airPLS-PLS-SVM 統計模型對測試集71 例血清的診斷效果，本統計模型診斷正確陽性9 例，診斷正確陰性60 例，見表2，靈敏度為100%，特異度為96.77%，準確率為97.18%，AUC為0.976。

圖5 6a 亞型與其他型PLS-1 ～PLS-6 散點圖及等高線圖

表2 RSairPLS-PLS-SVM統計模型診斷6a亞型的結果

3 討論

RS 的光學原理為拉曼散射，是印度科學家在1928 年發現的，當一定頻率的激光照射到樣本表面時，一部分光被發生偏離，其波長較入射光長且短，運動方向、頻率都發生變化，還有能量交換[8-9]。RS 技術具有快速、非侵入、非接觸、高靈敏度、高分辨率、高特異性等獨特優勢，已廣泛應用于生命科學、地質學、藥學、考古學等領域[9-10]。血清RS 圖譜一度被稱為“指紋圖譜”，通過RS 技術可發現患者因疾病而出現的蛋白質、核酸、脂類等的差異變化，憑借這一點血清RS 技術被用于臨床疾病的鑒別診斷[11-13]。

圖1 中虛線為HCV 組165 個樣本的平均譜圖，實線為非HCV 組120 個正常樣本的平均譜圖；圖1a 使用airPLS 扣除所得光譜圖的熒光背景后得到圖1b，可見airPLS 扣除熒光背景前存在較大噪聲干擾，這一操作是非常有必要的。進一步的數據分析比對得到圖1c，可見在HCV 組與非HCV 組300 ～3000 cm-1位移范圍內的血清RS 圖像形態相似，但部分位移處仍存在差異。這些差異可能與HCV 感染后導致的機體代謝或免疫變化有關，如血清中某些物質的成分、含量或結構發生改變，與健康人相比，HCV 患者血清中膠原蛋白、核酸、磷脂含量可能增加，兒糖類、氨基酸含量可能下降[14-15]。圖2 可見HCV 組與非HCV 9 個主成分在三維空間上存在部分重疊，但可區分開，這一點說明RS 技術能將HCV 患者血清與正常健康人血清區分開。圖3a 可見HCV 組與非HCV 組血清光譜數據被很好的區分開，RS 診斷HCV 的靈敏度為94.29%，特異度為96.15%，準確率為95.08%，AUC 為0.953；表明文中所用統計方法較可靠。

圖4a 使用airPLS 扣除所得光譜圖的熒光背景后得到圖4b，虛線為6a 亞型19 個樣本的平均譜圖，實線為146 個其他亞型樣本的平均譜圖，可見airPLS 扣除熒光背景前存在較大噪聲干擾，這一操作是非常有必要的。進一步的數據分析比對得到圖4c，可見在6a 亞型與其他亞型300 ～3000 cm-1位移范圍內的血清RS 圖像形態相似，但部分位移處仍存在差異。由圖5a、b 可見6a 亞型與其他型6 個主成分在三維空間上存在部分重疊，但可區分開，這一點說明RS 技術能將6a 亞型患者血清與其他型患者血清區分開。圖5c 可見6a 亞型與其他型血清光譜數據被很好的區分開。應用ROC曲線評估airPLS-PLS-SVM 統計模型對測試集71 例血清的診斷效果，本統計模型診斷正確陽性9 例，診斷正確陰性60 例，靈敏度為100%，特異度為96.77%，準確率為97.18%，AUC為0.976；說明RS 在6a 亞型鑒別中有較強的應用潛力。

綜上所述，血清RS 可用于HCV 診斷和6a 亞型的鑒別，有望成為HCV 快速篩查及分型工具，但國內相關報道并不多，本研究為RS 在HCV 診斷和6a 亞型鑒別的應用奠定良好基礎。但本研究樣本量較少，數據結果可能存在部分偏倚，仍需大樣本進一步證實。