胸腺基質(zhì)淋巴生成素對大鼠皮膚損傷修復(fù)作用及免疫機(jī)制研究

陳 駿

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院急診外科，福建福州 350003

皮膚損傷修復(fù)的分子機(jī)制仍未完全明確。輔助性T 細(xì)胞1（T Helper Tcells 1，Th1）與輔助性T細(xì)胞2（T Helper Tcells 2，Th2）平衡機(jī)制在皮膚損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)因子已成為目前研究熱點之一[1-3]。胸腺基質(zhì)淋巴生成素參與調(diào)控Th1 與Th2 平衡，可能在Th2 相關(guān)的炎癥性疾病的發(fā)生中起到主開關(guān)和調(diào)節(jié)器的作用[4]。目前，國內(nèi)外對皮膚損傷修復(fù)中胸腺基質(zhì)淋巴生成素免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究仍較為少見。本研究監(jiān)測了胸腺基質(zhì)淋巴生成素的表達(dá)水平及相關(guān)炎癥因子的濃度變化，為探討皮膚損傷修復(fù)過程中的免疫機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

SPF 級 雌 性 大 鼠52 只，6 ～8 周 齡，體 重180 ～200 g，購于北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，批號：SCXK（京）2014-0003，隨機(jī)分為觀察組與對照組，每組各26 只。主要試劑：血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；血清干擾素γ（Interferon γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（Interleukin 4，IL-4）、免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購于侖昌碩生物科技有限公司；兔抗鼠胸腺基質(zhì)淋巴生成素多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒均購于愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮膚損傷模型建立 觀察組大鼠實驗前1 周實驗室喂養(yǎng)，溫度22 ～24 ℃、濕度50%～60%，12 h 節(jié)律光照，自由飲食、進(jìn)食。實驗當(dāng)日禁食，按30 mg/kg 劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，用8%硫化鈉除凈大鼠背部體毛，面積約8cm×8cm，使用特制致傷器在大鼠脊柱兩側(cè)旁2 cm切割4 個圓形創(chuàng)面，直徑為1.5 cm，深至皮下，切割后止血。對照組大鼠僅背部脫毛。

1.2.2 血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE 檢測 造模后第3 天，兩組大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，剪尾采血約0.3 ～5 ml/只，室溫下靜置10 min，4000 r/min 離心10 min，收集上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE 濃度，試劑盒購于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司。

1.2.3 免疫組化檢測 取血后采集兩組大鼠背部脫毛處的皮膚組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，0.4 μm 連續(xù)切片，行SP 法免疫組化染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image-Pro Plus 5.0軟件讀取黃色或棕黃色細(xì)胞的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，相關(guān)性分析進(jìn)行Pearson分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果

胸腺基質(zhì)淋巴生成素陽性表達(dá)于細(xì)胞核，在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中未見陽性著色。觀察組平均光密度為（82.60±9.34），明顯高于對照組的（50.38±3.91），差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（t=24.381，P=0.000）。見圖1。

圖1 兩組大鼠皮膚組織免疫組化檢測結(jié)果（SP×400）

2.2 兩組血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比較

觀察組大鼠血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IL-4、IgE 水平明顯高于對照組，IFN-γ 水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比較（±s）

表1 兩組血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比較（±s）

組別 n胸腺基質(zhì)淋巴生成素（pg/ml）IFN-γ（ng/ml）IL-4（ng/ml）IgE（ng/ml）對照組26 138.24±20.51 72.46±7.58 62.48±6.70 15.91±4.65觀察組26 226.91±27.73 49.18±4.63 97.62±9.95 132.43±12.08 t 值 21.373 13.409 15.194 29.558 P 值 0.000 0.003 0.000 0.000

2.3 觀察組血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素與IFN-γ、IL-4、IgE相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，觀察組大鼠血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素與IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.731，P＜0.01），與IL-4、IgE 呈正相關(guān)（r=0.683，0.719，P＜0.01）。

3 討論

胸腺基質(zhì)淋巴生成素是白細(xì)胞介素17（Interleukin 17，IL-17）的類似物，在正常小鼠上皮中不表達(dá)，但在特應(yīng)性皮炎小鼠上皮細(xì)胞中存在高表達(dá)[5]。近年來研究顯示，胸腺基質(zhì)淋巴生成素可通過激活樹突細(xì)胞表達(dá)OX40 共刺激因子，啟動表面抗原分化簇4 受體（ cluster of differentiation 4 receptors，CD4+）T 細(xì)胞分化，生成Th2 促炎癥因子，促進(jìn)炎癥介質(zhì)大量生成，啟動過敏性炎癥反應(yīng)[6-8]。腫瘤壞死因子超家族成員（OX40 ligand，OX40）僅表達(dá)于活化的T 淋巴細(xì)胞表面，下調(diào)OX40 表達(dá)能夠有效抑制胸腺基質(zhì)淋巴生成素誘導(dǎo)的特應(yīng)性炎癥反應(yīng)[9]。激活的樹突細(xì)胞能夠合成并分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素18（Interleukin 18，IL-18），直接參與炎癥反應(yīng)過程，并產(chǎn)生炎癥聚集效應(yīng)[10-11]。胸腺基質(zhì)淋巴生成素直接作用于肥大細(xì)胞，促進(jìn)Th2 細(xì)胞因子和促因子[12-14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎患者中胸腺基質(zhì)淋巴生成素高表達(dá)能夠上調(diào)白細(xì)胞介素13（Interleukin 13，IL-13）水平，促進(jìn)皮膚纖維化[15]。但目前關(guān)于胸腺基質(zhì)淋巴生成素在皮膚損傷修復(fù)中作用的研究較少。皮膚損傷修復(fù)包括肉芽組織增生、其他組織再生、瘢痕形成等一系列過程，炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用[16-17]。

皮膚損傷修復(fù)過程中免疫炎癥反應(yīng)主要包括IgE 升高、Th1/Th2 失衡且以Th2 占優(yōu)勢以及由此引發(fā)的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子異常分泌[18]。Th2 細(xì)胞亞群主要分泌IL-4、白細(xì)胞介素10（Interleukin 10，IL-10）等炎癥因子，Th1 細(xì)胞亞群主要分泌IFN-γ、IL-2 等炎癥因子[19-21]。本實驗通過建立大鼠皮膚損傷模型，免疫組化檢測結(jié)果顯示，胸腺基質(zhì)淋巴生成素陽性表達(dá)于大鼠細(xì)胞核，且觀察組陽性表達(dá)率明顯高于對照組。觀察組大鼠血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素、IL-4、IgE 水平明顯高于對照組，IFN-γ 水平明顯低于對照組。其原因可能為，胸腺基質(zhì)淋巴生成素激活樹突細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞增殖活化為Th2 細(xì)胞，IL-4 分泌量明顯增加[22-23]；同時Th2 水平上升造成Th1 水平下降，IFN-γ 合成量減少[24-25]。相關(guān)性分析顯示，觀察組大鼠血清胸腺基質(zhì)淋巴生成素與IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)，與IL-4、IgE 呈正相關(guān)。提示胸腺基質(zhì)淋巴生成素通過影響IFN-γ、IL-4、IgE 表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，介導(dǎo)大鼠皮膚損傷的修復(fù)過程[26-27]。在以后的研究中可采用Western blot、RT-PCR 等技術(shù)從蛋白和基因水平上進(jìn)一步探討胸腺基質(zhì)淋巴生成素在皮膚損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)制。