HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的不確定度分析

陳恒沖 馬彬峽 孫曉寧

1.遼寧省本溪市藥品檢驗所，遼寧本溪 117000；2.遼寧省本溪市衛生學校，遼寧本溪 117000

測量不確定度是利用可獲得的信息，表征合理地賦予被測量量值分散性的非負參數[1]。通過評估不確定度，使檢驗結果由單一數值變為可能分布的數值范圍[2]，可有效提高檢驗結論的準確性和科學性[3-6]，尤其在檢測結果為邊緣值時，對結果符合性的判定起到重要作用。《中國藥品檢驗標準操作規范》2015 年版介紹了pH 值測定法、非水溶液滴定法等檢驗方法不確定度評定的實例[7]，說明測量結果不確定度評定與表示將在我國藥品檢驗領域全面應用，對我國藥品檢驗標準及檢測數據與國際接軌起到積極的推動作用[8-14]。

本研究根據《測量不確定度評定與表示 》[1]和《化學分析中不確定度的評估指南》[15]中的有關規定，利用在實驗室資質認定過程中對檢測方法確認研究的數據，對《中華人民共和國藥典》2015 年版一部正骨水含量測定的檢測結果不確定度進行評定分析[16]，并討論采用方法確認數據進行不確定度評定的優勢。

1 測定方法及不確定度來源分析

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（日本島津，2010AHT 型）；電子天平（德國 Sartorius，BT25S 型）；正骨水（廣西玉林制藥集團有限責任公司，批號：1811362）；丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：99.8%，批號：110708-201407）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為一級純化水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Aglilent zorbax C18（150 mm×5 mm）；流動相：乙腈-水-三乙胺-磷酸 （28∶72∶0.1∶0.1）；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：對照品溶液與供試品溶液各10 μl。

1.3 測量流程及結果計算模型

HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測量流程見圖 1。

圖1 丹皮酚含量測定流程圖

根據分析過程，丹皮酚的含量可用下面公式計算：

C χ為供試品中丹皮酚的含量（mg/ml）；Aχ為供試品溶液的峰面積；Ar為對照品溶液的峰面積；mr為對照品的稱樣量（mg）；P為對照品的純度，以質量分數的形式給出（%）；Dr為對照品溶液的稀釋倍數；Dχ為供試品溶液的稀釋倍數。

1.4 不確定度來源分析

從檢測過程和數學模型分析對HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測定結果有影響的因素，確定可能產生不確定度的所有來源，包括對照品稱量誤差和重復性，對照品溶液稀釋過程，供試品溶液稀釋過程，HPLC 進樣和峰面積積分的重復性等。HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度因果關系見圖2。

圖2 HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度來源

因為方法確認試驗中重復性和回收率的研究考慮了不同體積測量裝置校準的影響[15]，如果采用方法確認數據來評估測量不確定度，可將上述因果關系圖重新調整成圖3。重復性試驗測定了6 份平行配制的供試品溶液，對其不確定度分析可以涵蓋供試品溶液配制和測定的重復性不確定度，但卻不能涵蓋對照品溶液配制的不確定度，所以本例量取對照品溶液（1）另外配制6 份對照品溶液進行測定。通過回收率的測定及不確定度分析，可涵蓋由玻璃量器校準、進樣器容量誤差、溫度以及其他諸多因素帶來的不確定度。未被重復性及回收率的不確定度分析涵蓋的來源，如本研究中的對照品稱量、對照品純度，仍應分別予以考察。

圖3 HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度來源調整圖

2 測量不確定度評定

2.1 不確定度分量的量化

2.1.1 重復性（I，A 類評定）

2.1.1.1 供試品溶液重復性（Ix） 依法配制6 份供試品溶液分別測定峰面積，試驗數據見表1。供試品溶液重復性的相對標準不確定度：

2.1.1.2 對照品溶液重復性（Ir） 精密量取對照品溶液（1）2 ml，依法稀釋，平行配制6 份對照品溶液分別測定峰面積，試驗數據見表1。對照品溶液重復性的相對標準不確定度：

合成重復性相對標準不確定度：

2.1.2 回收率（Rec，A 類評定） 精密量取供試品溶液5 ml，對照品溶液（1）3.5 ml，置于同一25 ml量瓶中，稀釋至刻度。平行配制6 份依法測定，試驗數據見表1。回收率的相對標準不確定度 ：

2.1.3 對照品純度 丹皮酚對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，純度以99.8%計，但未提供其不確定度的信息，故本文不予評定。

表1 重復性及回收率試驗數據

2.1.4 對照品稱量（mr）

2.1.4.1 天平校準的不確定度（B 類評定） 所用電子天平（d=0.01 mg），依據計量檢定結果，最大示值誤差為±0.04 mg，按矩形分布計算，取包含因子，則標準不確定度為：

2.1.4.2 稱量重復性的不確定度（B 類評定） 依據計量檢定結果，重復性誤差為±0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，則標準不確定度為：

2.1.4.3 分辨率的不確定度（B 類評定） 天平的可讀性為0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，則標準不確定度為：

合成以上天平稱量不確定度來源，單次稱量的標準不確定度為：

因采用減量稱量，2 次讀數獨立不相關，對照品取樣量為15.02 mg，則其引入的相對標準不確定度為：

2.2 合成標準不確定度

合成相對標準不確定度：

實驗中測得丹皮酚含量為0.22 mg/ml，則合成標準不確定度：

2.3 擴展不確定度與報告

實驗結果一般用擴展不確定度表示，取包含因子 k=2（置信概率約95%），則含量測定結果的擴展不確定度為：

正骨水中丹皮酚的1 次含量測定結果可表示為（0.22±0.0018）mg/ml（k=2）。

2.4 各不確定度分量對比

對比各不確定度分量可以看出，回收率對不確定度的影響最大，其次為對照品稱量。見圖4。

圖4 測量不確定度的比較

3 討論

通過擴展不確定度與報告的結果可以看出，本實驗室依法測定正骨水中丹皮酚含量的不確定度較小，僅為測定結果的±0.8%，說明該測定方法穩定、準確，本實驗室出具的測定結果可信度較高。對比各不確定度分量可以看出，回收率對不確定度的影響最大，其次為對照品稱量。檢測過程中應重點關注回收率各影響因素的控制，保證高效液相色譜儀、玻璃量器均在穩定可控的范圍內使用，對照品溶液與供試品溶液在溫度穩定的環境中同時配制。同時，檢測人員應根據天平的精度和量程范圍選擇適宜的天平，并注意在稱量過程中規范操作。

在藥品檢測過程中，通常使用的將計算公式作為測量模型劃分不確定度分量的方式，本例利用重復性、回收率等方法確認研究數據進行不確定度評定，可同時覆蓋不同測定環節的檢測結果影響因素，簡化不確定度評定步驟，又可以包含供試品制備過程、基質干擾等無法量化和尚未考慮到的影響因素。但不同的檢測品種及項目，測定過程會有區別，應結合實際，全面考慮不確定度來源，合理設計方法確認試驗。

本研究僅采用了1 次方法確認的研究數據進行不確定度評定，樣本數量相對較少。如結合不同時間、不同分析人員的重復性試驗，即中間精密度的數據，以及多次回收率試驗的數據，可以不斷修正不確定度分量，更合理的評定不確定度。