抗核抗體熒光模型與滴度在自身免疫性疾病中的臨床分析

劉惠源 扶忠超 張允奇 尹志華 葉志中

1.深圳市福田區風濕病專科醫院風濕免疫實驗室，廣東深圳 518000；2.深圳市羅湖區人民醫院風濕免疫科，廣東深圳 518005

抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）是自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）重要的生物學標志[1]，常見于各種AID 中，可在發病前數年出現，還可見于惡性腫瘤、感染及健康人群中。ANA 檢測的方法有多種，早在1950 年由Coons和kaplan 提出間接免疫熒光法（IIFA）檢測，時至今日仍認為是“金標準”[2-3]。ENA（extractable nuclear antigen）抗體亦是AID 重要的自身抗體，對AID 的預測、診斷、病情活動均具有極其重要的臨床意義[3]。如ANA 熒光模型和特異性抗體一致，更具有臨床價值[4]。本研究通過分析AID 及非AID 的ANA 滴度、熒光模型等特征，旨在為臨床診療提供診療依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市福田區風濕病專科醫院2019 年6 月至2020 年6 月就診的153 例AID 患者，其中70 例系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、36 例類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）、9 例強直性脊柱炎（ ankylosing spondylitis，AS）、8 例干燥綜合征（sicca syndrome，SS）、3 例系統性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）、混合性結締組織病（mixed connective tissue disease，MCTD）和自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）各2 例，以及23 例未分化結締組織病（undifferentiated connective tissue disease，UCTD），設為AID 組；選取同期92 名非AID 患者或健康者設為非AID 組。AID 組男18 例，女135 例，平均年齡（41.2±12.3）歲；非AID 組男10 例，女82 例，平均年齡（42.9±9.8）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準均符合美國風濕病學會或肝病學會診斷/ 分類標準。排除標準：伴基礎性疾病（如高血壓、糖尿病、肝炎、結核、腫瘤等）者。

1.2 儀器與與試劑

免疫熒光顯微鏡EUROStar ⅢPlus 及間接免疫熒光法檢測試劑盒（美國沃芬公司，生產批號053387）。QUANTA-Lyser 儀器及抗ds-DNA 抗體試劑盒（美國沃芬公司，生產批號053121）。

1.3 方法

采用間接免疫熒光法檢測ANA。①樣本準備：標本、試劑、緩沖液；②檢驗操作：制備基質載玻片，孵育載玻片，清洗載玻片，加入熒光素標記的結合物，清洗載玻片；③結果判讀：在顯微鏡下觀察熒光模型，根據熒光亮度判讀滴度。滴度≥1 ∶100 為陽性。采用酶聯免疫法檢測抗ds-DNA 抗體，按照操作說明依次加入1 ～3 號標準品、陰性、陽性對照，根據標準品檢測值繪制出參數曲線，計算結果，臨界值為200.0 U/ml。所有研究對象均采取空腹血清，樣本均嚴格按照說明書進行檢測。

1.4 觀察指標

分析兩組ANA 陽性率、ANA 模型、滴度分布情況及差異，以及系統性紅斑狼瘡（SLE）患者ANA滴度與dsDNA 濃度的關系。

1.5 統計學處理

應用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布數據用（）表示，計量資料比較采用t檢驗，非正態分布數據采用中位數（四分位數）表示。采用Spearman相關性分析比較兩組的相關性，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AID組主要熒光模型分布情況

ANA 陽性率為83.0%（127/153）。熒光模型以均質型28.1%（43/153）、核顆粒型31.4%（48/153）、混合型9.2%（14/153）為主，其中混合型主要為核顆粒/ 胞漿顆粒占35.7%（5/14），SLE 以核顆粒型為主42.8%（30/70），RA 均質、核顆粒型占63.9%（23/36），SSc 均為著絲點型。見表1。

2.2 AID患者的ANA滴度分布情況

AID 患 者ANA 滴 度（中 位 數）為1 ∶1000，除了AS、RA、UCTD 患者ANA 滴度（中位數）均為1 ∶320，其他AID 患者ANA 滴度（中位數）均≥1 ∶1000，其中SS 患者ANA 滴度（中位數）為1 ∶3200，SLE、SSc、MCTD、AIH 患者ANA 滴度（中位數）均為1：1000。見圖1。

表1 AID患者ANA熒光模型分布[n（%）]

圖1 不同AID 患者ANA 的滴度（中位數）

2.3 SLE患者ANA滴度與抗ds-DNA抗體的相關性分析

SLE 患者ANA 滴度（中位數）為1 ∶1000，與抗ds-DNA 抗體濃度呈正相關（r=0.538，P＜0.05），抗ds-DNA 抗體陽性、陰性組ANA 滴度（中位數）分別為1：3200 和1 ∶320。見圖2。

圖2 SLE、抗ds-DNA 抗體陰性及陽性的滴度（中位數）

2.4 非AID者ANA熒光模型與滴度

非AID 組ANA 陽 性 率 為13.0%（12/92），AID 組ANA 陽性率為83.0%（127/153），差異有統計學意義（P＜0.05）。非AID 組模型以致密顆粒型8 例為主，均質型、核顆粒型各2 例，滴度均為1 ∶100。AID 組和非AID 組ANA 滴度（中位數）分別為1 ∶1000 和1 ∶100。見圖3。

圖3 AID 組與非AID 組滴度（中位數）

3 討論

ANA 在AID 的診斷中起著重要作用，ANA 滴度被認為與臨床密切相關[4]，對疾病的診斷和病情的評估有重要價值[5]。熒光模型提示著特異抗原，可能是同源的自身抗體與某些疾病或疾病的表現有關。ANA 模型可能與疾病相關性比特異性抗原更大[4]。因此如果高度懷疑存在某種疾病特異性靶抗原的熒光模型，應建議臨床醫生進一步檢測特異性抗體，有助于疾病的早期診斷和治療[5]。

本研究通過分析不同AID 中ANA 熒光模型、滴度、抗體的差異以及非AID 人群ANA 的檢出情況，為臨床工作提供幫助。研究顯示AID 組ANA陽性率為83.0%，與陳水綿等[6]結果相近，非AID組陽性率13.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），AID 組中均質型、核顆粒型在SLE、RA、UCTD 中的陽性率高于其他模型。SLE 模型以核顆粒型為主（42.8%），與劉衛霞等[7]報道核顆粒型占比46.7%相似。SSc 患者模型均為著絲點型。在SSc 的分類標準中抗著絲粒抗體被認為是特異性抗體，IIF 可檢測的ANA 熒光模型多為著絲點型[8]。雖然特定熒光模型與某些ANA 靶抗原的特異性自身抗體、AID 及特定臨床表現存在一定的相關性，但并非完全一致，不能僅從熒光模型來推斷AID[1]。

不同AID 患者滴度不一樣，本研究結果顯示，除AS、RA、UCTD 患者ANA 滴度（中位數）均為1 ∶320 外，其他AID 患者ANA 滴度（中位數）均≥1 ∶1000，其中SS 患者ANA 滴度（中位數）為1 ∶3200，SLE、SSc、MCTD、AIH 患者ANA 滴度（中位數）均為1 ∶1000。因此，RA、AS 中的ANA 滴度對診斷的參考意義不大。UCTD 的滴度亦較低，因UCTD 可能進一步發展為其他AID，可理解為早期AID，因此可能隨著病情發展，演變成SLE、SS 等AID 后其滴度亦可能改變。高滴度ANA 意味著特異性抗原被識別的機會增加[4]。Banhuk 等[9]研究顯示高滴度ANA 與AID 密切相關。

ANA 滴度在預后中發揮重要作用[10]，目前關于病情活動與滴度相關性研究較少報道，本研究發現SLE 患者中ANA 滴度與抗ds-DNA 抗體濃度呈正相關（r=0.538，P＜0.05），可能與病情活動有關，可用于監測病情及預后。然而本研究的樣本量相對較少，需進行大樣本及多中心研究進一步證實。

健康人群中ANA 呈弱表達，特別是老年健康人群中[10]。本研究非AID 人群中ANA 陽性率為13.0%，與Mariz 等[11]研 究 結 果ANA 占12.9% 相近。有文獻報道低滴度ANA 甚至可能出現在高達40%的健康人群中[12]，Marin 等[13]研究發現在健康人群、AID 患者家屬及醫療工作者共304 人中ANA可檢測出熒光模型的比例為54.3%，其中35.4%為1 ∶40 低滴度，認為ANA 一般不應在沒有臨床適應證的情況下進行檢測，有趣的是AID 患者的醫生和親屬ANA 滴度往往增加。本研究顯示，非AID人群中，以致密顆粒為主，均為低滴度。HEp-2 細胞致密顆粒（DFS）模型可能是ANA 相關性風濕病（AARD）的排除性標記，甚至可能發揮保護或有益的作用[14]。致密顆粒型在健康人群中更常見[11，15]，而均質型只在AID 患者中觀察到[11]。因此不同模型在不同個體的意義不一樣。

熒光模型及滴度始終應根據臨床背景進行分析[16]。不同AID 患者ANA 模型、滴度分布情況不一樣，健康人群亦有一定的ANA 陽性率，如檢測中出現致密顆粒型，需謹慎診斷為AID。臨床醫師需關注ANA 模型和滴度的價值，特殊模型可提示特殊疾病，低滴度ANA 的臨床意義較小，高滴度則需積極尋找靶抗原，如無臨床癥狀，應密切隨訪。