免疫比濁法測定血清淀粉樣蛋白A的鉤狀效應及其解決方案

朱 雨 梁忠柱 張甲波 徐 運 胡苗苗 吳澤東

安徽伊普諾康生物技術股份有限公司，安徽合肥 230000

血清淀粉樣蛋白A（SAA）是由肝細胞分泌的一種急性反應蛋白，是臨床上診斷病毒、細菌感染等重要指標[1]。機體感染時，SAA 短時間內濃度快速上升，病原體清除后又迅速恢復到正常水平，具有快升快降的特點，臨床檢測中容易出現高劑量鉤狀效應，導致假陰性現象的發生[2]。因此在研制SAA 檢測試劑盒及其臨床應用中，必須注意并設法解決鉤狀效應[3]。本研究報道了研制SAA 試劑盒及臨床檢測實踐中，由于鉤狀效應而導致的假陰性現象，并提出解決方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標本來源：83 個定值血清，購自西門子醫療系統有限公司。儀器：美國貝克曼庫爾特AU680 全自動化學分析儀。試劑盒：安徽伊普諾康生物技術股份有限公司生產的SAA 檢測試劑盒（乳膠增強免疫比濁法，批號2019040101）、其他公司的SAA 檢測試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 SAA 試劑盒的線性范圍分析 采用西門子定值血清樣本，通過倍比稀釋的方式，稀釋成5 個不同梯度濃度，每個稀釋濃度樣本測定2 次，分別求出測試結果的均值。以稀釋濃度為自變量，以測定結果均值為因變量求出線性回歸方程，同時計算線性絕對偏差或相對偏差。

1.2.2 SAA 試劑盒的準確度分析 選取高、低兩個不同水平的定值血清樣本進行測試，每個濃度的樣本重復測定3 次，計算實測值與樣本定值偏差大小，評定準確度。

1.2.3 SAA 試劑盒的精密度分析 選取高、低兩個不同水平的定值血清樣本進行測試，每個濃度重復20 次，最終計算其平均值、標準偏差、精密度大小，評定精密度。

1.2.4 定值血清的SAA 檢測 用SAA 試劑盒檢測83 份定值血清樣本的SAA，用美國貝克曼庫爾特AU680 全自動化學分析儀分析數據，按試劑說明書步驟操作。根據測定結果，以定值血清數據為參照，進行測定數據與定值血清數據相關性分析。

1.2.5 鉤狀效應分析 取超高值樣本定值血清，用研發的SAA 試劑盒和其他公司的SAA 試劑盒同時檢測SAA，分析檢測SAA 高值樣本時是否會出現鉤狀效應，并用Excel 表格做出相應的散點圖和趨勢線。

1.2.6 勾狀效應解決方案 將53、59 和61 這3 個高值樣本用9 g/L 氯化鈉溶液進行梯度倍比稀釋，每稀釋一次都重新進行測定，直到稀釋后的樣本測定值在線性范圍內（1 ～200 mg/L），將樣本的定值濃度除以相應的稀釋倍數設定為樣本理論定值，根據稀釋后測定值與理論定值是否一致，判斷稀釋法是否能解決鉤狀效應。

2 結果

2.1 SAA試劑盒的線性范圍分析

在1 ～200 mg/L 濃度范圍內，理論定值與實測均值相近，偏差均＜3%。見表1。由圖1 可見，在1 ～200 mg/L 濃度范圍內，樣本梯度稀釋后，實測均值與理論定值的相關性好，相關系數r=0.9997，大于所規定的0.975。因此，試劑的線性范圍為1 ～200 mg/L，線性范圍較寬，有足夠的應用優勢。

表1 SAA試劑盒線性范圍測定

圖1 線性范圍內實測均值與理論定值的相關性分析

2.2 SAA試劑盒的準確度分析

高、低兩個不同水平的定值血清樣本所測定的SAA 數值與樣本定值之間的偏差在20%以內，具有較高的準確度[4]。見表2。

表2 準確度分析結果

2.3 SAA試劑盒的精密度分析

檢測高、低兩個不同水平樣本的重復性，其精密度CV 均＜3.0%，具有較高的精密度[5]。見表3。

2.4 定值血清的SAA檢測

測定值與定值偏差過大的樣本，如樣本53、59、61 所測定的數據明顯低于西門子定值，同時對于SAA 超高值的檢測，出現檢測結果變小的現象。見 表4。由圖2 ～ 3 可見，樣本53、59、61 的數據明顯偏離回歸方程式，當剔除三個偏離樣本，在進一步進行相關性分析時，得到的回歸方程為Y=1.4363x-1.6883，r=0.9948，相關系數r＞0.975，數據的相關性很好，表明53、59、61 三個樣本的測定數值存在異常，可能為鉤狀效應所致。

表3 精密度分析結果

表4 部分定值血清的測定結果與定值比較

圖2 定值血清的測定值與定值的相關性分析

圖3 剔除偏離樣本后定值血清的測定值與定值的相關性分析

2.5 鉤狀效應分析

用研制的SAA 試劑盒檢測超高值SAA 定值血清，與其他公司的SAA 試劑檢測結果比較，做出相應的散點圖，見圖4 ～6。1 ～1000 mg/L 濃度范圍的定值血清擬合曲線圖中，兩種SAA 試劑在1 ～200 mg/L 的濃度范圍內其定值和實測值基本一致，而超出200 mg/L 的測定值明顯低于定值，但擬合曲線未出現明顯的下降趨勢。而在1 ～2000 mg/L、1 ～3000 mg/L 濃度范圍定值血清的擬合曲線圖中，濃度范圍超出500 mg/L 的測定值與定值相差甚遠，且整體曲線有明顯的下降趨勢，明顯存在鉤狀效應。

圖4 濃度范圍1 ～1000 mg/L 定值血清的SAA 檢測結果擬合曲線圖

圖5 濃度范圍1 ～2000 mg/L 定值血清的SAA 檢測結果擬合曲線圖

圖6 濃度范圍1 ～3000 mg/L 定值血清的SAA 檢測結果擬合曲線圖

2.6 稀釋法解決鉤狀效應

對樣本53（定值1250.0 mg/L）、59（定值412.8 mg/L）、61（定值883.2 mg/L）進行倍比稀釋并測定，直至測定值在SAA 試劑的線性范圍內（1 ～200 mg/L）。樣本53、59、61 在稀釋16 倍之后，測定值與理論定值基本一致，表明稀釋法能夠成功解決鉤狀效應產生的影響。見表5。

表5 稀釋法解決鉤狀效應結果

3 討論

免疫比濁法是將比濁法和免疫反應結合起來的檢測方法[6-7]，反應體系中的抗原抗體只能在合適比例范圍內發生免疫凝集反應，當抗體或者抗原過量時會導致假陰性或者弱陽性的現象，即鉤狀效應[8]。有文獻報道在檢測甲胎蛋白時，發現3 例由于鉤狀效應而導致的錯誤結果[9]，也有報道提示鉤狀效應會導致強陽性樣本易誤測為弱陽性樣本[10]。鉤狀效應不僅發生在免疫比濁檢測中，在免疫法檢測中普遍存在[11]，而臨床上鉤狀效應的發生，會導致檢測結果出現假陰性或弱陽性，從而影響診療，所以對于臨床上鉤狀效應的解決至關重要[12]。

SAA 是較為敏感的急性期反應蛋白，在感染性疾病的篩查和診斷中有重要意義[13]，其檢測結果的正確性和穩定性與患者的治療密切相關，鉤狀效應可能導致相關疾病的誤判從而延誤患者的治療[14]。同時SAA 具有快升快降的特點，容易導致鉤狀效應的發生，且臨床檢測工作中，由于待檢樣本很多，在不同患者中SAA 水平存在巨大差異，因此單從檢測和診斷結果上通常難以發現錯誤的存在[15]。因此在研制SAA 檢測試劑盒及臨床檢測過程中，必須注意并設法解決鉤狀效應。

在SAA 試劑盒的研制和使用過程中，發現測定值與定值之間的偏差過大的樣本，如樣本53、59、61 所測定的數據明顯低于定值，同時對于SAA 超高值的檢測，出現檢測結果變小的現象。經鑒定，研制的SAA 試劑盒的線性范圍廣、測定結果精確度高、結果準確可靠，可以排除試劑盒性能因素的影響。進一步用研制的SAA 試劑盒測定超高值SAA定值血清，與其他公司的SAA 試劑測定結果比較，結果表明1 ～1000 mg/L 濃度范圍的擬合曲線圖中，在1 ～200 mg/L 的濃度范圍內其定值和實測值基本一致，而超出200 mg/L 之后的測定值，實測值明顯低于定值，但曲線未出現明顯的下降趨勢。在1 ～2000 mg/L、1 ～3000 mg/L 濃度范圍的曲線圖中，濃度范圍超出500 mg/L 的測定數值與定值相差甚遠，且整體曲線有明顯的下降趨勢，明顯存在鉤狀效應。

嘗試用稀釋法解決鉤狀效應問題，即將測定結果中超出線性范圍的樣本視為超高值樣本，對其進行梯度倍比稀釋，每稀釋一次都重新進行測定，直到稀釋后的樣本測定值在線性范圍內（1 ～200 mg/L），最終測定值乘以稀釋倍數，即為樣本真實值，結果表明稀釋法成功解決了鉤狀效應所帶來的影響。