攜ICAM-1靶向超聲造影評估動脈粥樣硬化兔心肌微循環的實驗研究

金 琳，李 萍，鈕培玉，王 歡

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery atherosclerotic heart disease，CAD)簡稱冠心病，在我國發病率呈逐年升高趨勢，心血管高危因素，如高血壓、糖尿病、高脂血癥等導致亞臨床心臟受累，早期發現心臟功能損害，對降低心血管病病人死亡率和延長壽命具有重要的臨床意義[1]。實時心肌聲學造影(myocardial contrast echocardiography，MCE)可顯示心肌微循環[2]。本研究應用攜細胞間黏附分子-1(ICAM-1)靶向超聲造影劑評估動脈粥樣硬化兔心肌微循環，旨在探討其應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 選取雄性新西蘭大白兔16只，體質量(2.14±0.13)kg，4～5個月齡，均購自上海市甲干生物科技有限公司，隨機分為對照組及動脈硬化組，各8只。對照組給予普通飼料，動脈硬化組給予高脂飼料，兩組實驗兔飼養12周。高脂-膽固醇飼料成分包括普通飼料75.5%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇4%、膽鹽0.5%。USphereTM超聲微泡購自南京云橋生物技術有限公司，ICAM-1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 實驗儀器及設備 配備具有造影功能的超聲診斷儀(Toshiba Aplio800)，設置探頭頻率為9～18 MHz；UltraMix振蕩器；渦旋震蕩儀Vortex-QL-861。

1.3 攜ICAM-1單抗靶向超聲微泡的制備 以生物素親和素鏈接法制備攜抗ICAM-1超聲靶向微泡。應用UltraMix振蕩器(頻率200次/min)將標記親和素的USphereTM超聲裸微泡及Biotin/FITC-ICAM-1抗體渦旋震蕩，充分混懸10 s后置于室溫下孵育30 min，離心去除多余抗體，流式細胞儀檢測Biotin/FITC-ICAM-1與微泡的結合率。

1.4 常規超聲心動圖檢查 取左心室乳頭肌水平短軸切面，M型超聲心動圖記錄前間隔、左室后壁運動曲線，測量室間隔舒張期厚度(IVS)和左室后壁舒張期厚度(LVPW)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)，計算左室射血分數(LVEF)，每只實驗兔測定3個心動周期，取平均值。

1.5 MCE方法 實驗兔肌肉注射0.1 mL/kg的速新眠進行麻醉，仰臥位于操作床上，剔除腹部毛發，于耳緣靜脈置入留置針。16只實驗兔選擇左心室乳頭肌水平短軸切面行MCE檢查，超聲探頭頻率為18 MHz，深度1 cm，幀頻45幀/s，機械指數0.08，造影過程中保持各參數不變，微泡造影劑以0.15 mL/(kg·min)連續緩慢注射，之后注射1 mL生理鹽水沖洗。待心肌造影劑回聲強度達到穩定狀態時，發射連續10幀的高能量聲束，心肌內微泡完全破壞后，切換為實時造影模式，獲得心肌再灌注的實時動態圖像。根據美國心臟病學會推薦的16節段分析法，將左心室乳頭肌水平短軸切面分為前壁、前間隔、后間隔、下壁、后側壁和前側壁6個節段，將感興趣區(region of interest，ROI)置于6個節段中央，取樣大小盡量包括整個心肌厚度，避免心內膜和心外膜干擾，對心肌再灌注圖像分析時間-強度曲線，獲取參數達峰強度(peak intensity，PI)、達峰時間(time to peak，TTP)，整體心肌血流灌注參數取各節段平均值。

1.6 實驗室及病理檢查 經耳中動脈采集空腹血5 mL，檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。心肌造影完成后處死實驗兔，乳頭肌水平垂直于心臟長軸取左室心肌，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

2 結 果

2.1 兩組血脂和常規超聲心動圖指標比較 動脈硬化組TG、TC、HDL-C及LDL-C均高于對照組(P<0.01)；兩組心率、IVS、LVPW、LVESD、LVEDD及LVEF比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組血脂和常規超聲心動圖指標比較(±s)

2.2 實驗兔MCE結果 左室乳頭肌水平短軸切面MCE顯示，兩組實驗兔心肌血流灌注呈均勻一致性，未見明顯心肌節段性灌注缺損。觀察3 min后，對照組兔心肌內造影劑已消退不顯影，動脈硬化組兔可見少量造影劑持續顯影。詳見圖1。整體心肌灌注分析顯示，動脈硬化組PI低于對照組，TTP晚于對照組(P<0.01)。詳見表2。

圖1 兩組實驗兔MCE圖像

表2 兩組心肌灌注參數比較(±s)

2.3 實驗兔心肌組織病理結果 HE染色結果顯示：動脈硬化組及對照組心外膜下冠狀動脈及心肌內小動脈均無明顯粥樣硬化斑塊形成。對照組兔心肌細胞形態、排列及間質未見明顯異常，動脈硬化組兔心肌細胞可見脂肪變性。詳見圖2。

圖2 兩組實驗兔心肌組織HE染色圖

3 討 論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的重要病理學基礎，與心肌梗死、心力衰竭等心血管不良事件發生呈正相關[3]。CAD基本病理機制是冠狀動脈粥樣硬化導致冠狀動脈血流下降[4]，局部心肌血流灌注降低和心肌功能異常。

慢性動脈粥樣硬化中，心肌微血管在不伴有冠狀動脈粥樣硬化時即出現內皮功能損害，大動脈內皮功能損害可能出現在明顯的病理改變之前[5-6]，心肌微血管內皮功能不全導致血管舒縮功能異常，從而導致心肌灌注下降。冠狀動脈微循環疾病臨床表現無特異性，早期識別及正確評估心肌灌注異常對預防和治療疾病具有重要的臨床意義。

MCE是一項無創性評價心肌血流灌注的影像學技術，可實時、準確、定量分析心肌血流灌注[7]。MCE臨床研究顯示，局部心肌血流灌注異常早于心功能異常[8]。靶向超聲造影劑作為一種分子顯像劑，造影劑微泡通過配體的靶向作用，可構建主動性靶向超聲微泡，特異性聚集于組織器官靶點，增強局部顯影效果，提高病變檢出率和診斷精確性[9]。內皮細胞功能障礙過程中，ICAM-1等炎性因子表達上調，可作為靶向超聲成像測定的靶點[10]。攜ICAM-1微泡對損傷血管內皮的靶向性，使用超聲顯像可無創評估炎癥或內皮損傷部位。

MCE檢查造影劑灌注量與心肌微循環呈正相關，增強強度越高，提示心肌微循環越好[11]。本研究中動脈硬化組兔心肌灌注降低，考慮是心肌微循環減少。ICAM-1靶向造影劑增強強度不僅可反映心肌微循環情況，且與靶向顯影作用相關。本研究應用ICAM-1靶向造影劑發現，動脈硬化兔心肌造影劑PI降低，TTP均晚于正常實驗兔，表明CAD心肌微循環減少，ICAM-1表達增高，ICAM-1微泡聚集并停留于內皮損傷明顯節段，超聲顯像可顯示微泡回聲，從而得到無創評估微循環障礙部位及嚴重程度。因此，心肌缺血時靶向造影劑MCE檢查對血管內皮損傷敏感性較高，其顯示的心肌灌注異常早于傳統超聲心動圖顯像。

綜上所述，攜ICAM-1靶向超聲微泡可敏感地對動脈粥樣硬化兔心肌微循環障礙進行靶向性診斷，作為CAD早期診斷和動態療效監測的有效方法，具有一定的臨床意義，同時為CAD靶向治療提供了一定的可行性，今后實驗研究可進一步證實該結論。