珍斛顆粒對(duì)肝陽上亢型高血壓病人血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

楊 丹，葉 攀，蔡三金，劉宏軍，敖杰男

高血壓具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn)，是心腦血管疾病死亡的主要原因之一。高血壓是常見的慢性非傳染病之一，長(zhǎng)期血壓升高導(dǎo)致機(jī)體心、腦、腎及視網(wǎng)膜等重要靶器官損傷和衰竭。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高血壓屬“眩暈病”，主要病機(jī)為痰濁內(nèi)阻、肝陽上亢、瘀血阻絡(luò)、腎陽不足等。臨床研究表明，眩暈病常見的臨床病機(jī)是肝陽上亢[1]。有研究顯示，中醫(yī)方劑能有效控制病人血壓，改善臨床癥狀，并有助于下調(diào)內(nèi)皮素1(ET-1)水平，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善血管功能[2]。珍斛顆粒是宜昌市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，功效為平肝息風(fēng)、滋陰潛陽[3]。本研究觀察珍斛顆粒對(duì)肝陽上亢型高血壓病人血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA和血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)mRNA的影響。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 高血壓診斷及分級(jí)參照《中國(guó)高血壓防治指南(2019年修訂版第三版)》制定；肝陽上亢辨證分型參照《證候類中藥新藥臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2018版)中醫(yī)高血壓診斷的分型標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡>40歲，性別不限；確診為原發(fā)性高血壓3級(jí)；根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中醫(yī)辨證分型為肝陽上亢型[5]，主要癥狀：頭暈?zāi)垦！㈩^脹頭痛；次要癥狀：煩躁易怒、口苦咽干、面色潮紅、潮熱多夢(mèng)、夜寐不安，舌質(zhì)紅，苔薄黃，脈弦有力；符合主要癥狀及兩項(xiàng)次要癥狀即可納入。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有病人均簽署知情同意書。

1.1.3 病例排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)；高血壓靶器官損害，包括心絞痛、心肌梗死、嚴(yán)重心力衰竭、腦卒中、動(dòng)脈夾層、視網(wǎng)膜出血等；合并嚴(yán)重消化道出血、呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)疾病及精神疾病等；肝腎功能異常，血肌酐超過正常上限；妊娠期高血壓；對(duì)研究藥物過敏；3個(gè)月內(nèi)曾參與其他藥物研究。

1.2 臨床資料 選取三峽大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管科收治的病人90例為研究對(duì)象，其中男46例，女44例；年齡(57.4±9.5)歲；病程0.3～26.0(15.1±8.9)年；用藥前血壓(171.2±16.9)/(105.4±15.1)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和藥物組，各30例。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。同時(shí)選取年齡、性別匹配的健康志愿者30名作為正常組。

1.3 治療方法 對(duì)照組給予常規(guī)降壓治療，藥物組給予珍斛顆粒聯(lián)合常規(guī)降壓治療，珍斛顆粒由宜昌市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供，組方：珍珠母30 g，石斛15 g，煅龍牡30 g，石決明20 g，玄參15 g，夏枯草10 g，懷牛膝15 g，野菊花15 g，每日3次口服，飯后服用，每次200 mL，規(guī)律服藥2個(gè)月待血壓持續(xù)達(dá)標(biāo)后采集受試者血液。各組研究對(duì)象治療期間均按照要求給予低鹽、低脂飲食，規(guī)律作息，調(diào)暢情志，忌煙、酒，忌用抗生素等可能影響試驗(yàn)結(jié)果藥物。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料 抽取健康志愿者、模型組病人服藥前、藥物組病人常規(guī)服用常規(guī)降壓藥物達(dá)標(biāo)并連續(xù)服用珍斛顆粒2個(gè)月后、對(duì)照組病人服用常規(guī)降壓藥物達(dá)標(biāo)2個(gè)月后血液，均提取血清。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)，由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4.2 主要試劑 購自杭州四季青公司的胎牛血清、胰蛋白酶、含1%雙抗DMEM培養(yǎng)基；購自美國(guó)Invitrogen公司的Trizol總RNA提取試劑盒、RT-實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)試劑盒。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)儀器 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的CO2培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)；蘇州博力斯公司的超凈工作臺(tái)；美國(guó)Syngene公司的全自動(dòng)凝膠成像分析儀及分析系統(tǒng)；日本ASTEC公司的梯度基因擴(kuò)增儀和電泳槽；引物合成試劑盒由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 復(fù)蘇的凍存HUVEC-C細(xì)胞株，置于氣相：空氣95%，CO25%；溫度37 ℃，培養(yǎng)箱濕度70%～80%，DMEM培養(yǎng)基含15%胎牛血清及含1%雙抗，細(xì)胞生長(zhǎng)接近指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：正常組用含10%健康志愿者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；模型組用含10%肝陽上亢型高血壓病人服藥前血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；藥物組用含10%藥物組病人服藥后血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對(duì)照組用含10%對(duì)照組研究對(duì)象血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每組9個(gè)復(fù)孔。

1.4.4.2 PCR測(cè)定HUVEC-C中ET-1 mRNA和TM mRNA表達(dá) 離心各組懸浮細(xì)胞備用，參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA。ET-1、TM和內(nèi)參照β-actin，GAPDH和引物借助primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)Genebank驗(yàn)證，詳見表2。總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)體系50 μL，存放于-20 ℃。ET-1反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。TM反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)，94 ℃變性40 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。各取PCR產(chǎn)物DNA 5 μL+dd H2O 3 μL+溴酚藍(lán)2 μL共10 μL混合后依次滴入加樣孔中，于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳約1 h(電壓90 V)，清水漂洗后置于紫外線透射儀上觀察結(jié)果，并通過凝膠攝像系統(tǒng)照相記錄，光密度掃描儀分析各條帶光密度，以β-actin、GAPDH表達(dá)量為對(duì)照計(jì)算并比較各組ET-1 mRNA、TM mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 RT-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 各組PCR電泳圖 分析結(jié)果表明，與正常組比較，模型組ET-1 mRNA產(chǎn)物條亮度最強(qiáng)，表明表達(dá)增多，TM mRNA產(chǎn)物條帶亮度最暗，說明表達(dá)減少，藥物組和對(duì)照組ET-1 mRNA、TM mRNA產(chǎn)物條帶亮度介于模型組和正常組之間。詳見圖1、圖2。

圖1 PCR檢測(cè)ET-1 mRNA表達(dá)

圖2 PCR檢測(cè)TM mRNA表達(dá)

2.2 各組ET-1 mRNA和TM mRNA表達(dá)比較(見表2)

表2 各組ET-1 mRNA和TM mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

高血壓患病率高，但知曉率、治療率及控制率較低，是世界范圍內(nèi)的心血管疾病防治難題。高血壓作為一種全身性疾病，長(zhǎng)期患病且血壓控制不佳對(duì)機(jī)體多個(gè)重要臟器造成不同程度的功能性和器質(zhì)性損害，特別在高致死率心血管疾病中高血壓是首要危險(xiǎn)因素。目前，高血壓主要采用西藥治療，但由于西藥種類較多，受服藥禁忌證、不良作用及服藥依從性等影響，我國(guó)中醫(yī)學(xué)的整體觀及辨證論治觀點(diǎn)在高血壓的治療上具有較大優(yōu)勢(shì)。本研究在高血壓基礎(chǔ)上將中醫(yī)辨證施治應(yīng)用于高血壓的防治中，總結(jié)歸納多年醫(yī)療實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制了具有平肝息風(fēng)、滋陰潛陽的珍斛顆粒。

心血管性疾病的病理基礎(chǔ)是內(nèi)皮細(xì)胞損傷，高血壓病人血壓升高導(dǎo)致血管因長(zhǎng)期壓力負(fù)荷過重，出現(xiàn)持續(xù)性血管痙攣及血管內(nèi)膜損傷，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)和纖溶系統(tǒng)失衡，脂質(zhì)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變[7]。有研究證實(shí)，血管壓力持續(xù)升高造成血管內(nèi)皮出現(xiàn)病理性損傷，引起一系列炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)失衡[8]。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞通過合成和分泌生物活性因子調(diào)節(jié)血管收縮和舒張，控制血壓水平，并且具有維持抗凝和纖溶平衡功能。

ET-1是由內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的，具有強(qiáng)烈而持久的縮血管作用，還可促進(jìn)細(xì)胞增殖和肥大，最終引起細(xì)胞凋亡和血管粥樣硬化[9]。高血壓引起動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，與ET-1過度表達(dá)有關(guān)，有效控制血壓和降低ET-1可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)生。如何調(diào)節(jié)ET和一氧化氮合酶系統(tǒng)平衡已成為預(yù)防和阻止動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心腦血管疾病的研究熱點(diǎn)。

TM是存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的單鏈抗凝糖蛋白和細(xì)胞膜的凝血酶調(diào)節(jié)蛋白，即凝血酶受體。TM是反映內(nèi)皮細(xì)胞受損的敏感特異標(biāo)志物之一，可調(diào)節(jié)機(jī)體凝血功能，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，凝血酶釋放到血液中，從而啟動(dòng)體內(nèi)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)，引起血栓性疾病[10]。TM能有效降低凝血酶活性，防止凝血系統(tǒng)過度激活，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。相關(guān)研究表明，TM與動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成等凝血功能病理變化密切相關(guān)[11]。

珍斛顆粒是宜昌市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要組分珍珠母能平肝潛陽、清肝瀉火；石斛具有滋陰清熱的功效。該方能有效控制病人血壓并改善癥狀。本研究采用病證結(jié)合型，將高血壓肝陽上亢型病人血清作為模型，避免動(dòng)物造模辨證困難等相關(guān)問題。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，肝陽上亢型高血壓病人可能通過ET-1 mRNA和TM mRNA表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，珍斛顆粒可降低肝陽上亢型高血壓病人血清ET-1 mRNA表達(dá)，上調(diào)TM mRNA表達(dá)，從而有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。