口腔鱗狀細(xì)胞癌中p16、p53表達(dá)的臨床意義評估

高永政，劉先檔，林渝凱，謝昊，呂威廷，李遠(yuǎn)兆，鄭錦花

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541000)

0 引言

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中口腔鱗狀細(xì)胞癌占到50%，應(yīng)用早期診斷和評估預(yù)后的相關(guān)因素與患者的生存質(zhì)量密切相關(guān)。口腔鱗狀癌的主要致病因素有煙草、酒精、HPV、環(huán)境污染物等引起基因組突變致癌。Shanthi Marur的回顧分析表明HPV相關(guān)頭頸癌的特征在于p53突變和p16的下調(diào)[1]。而CastellsaguéX等人的大型國際研究表明HPV在相關(guān)頭頸部癌中發(fā)揮重要作用，并通過HPV生物活性相關(guān)的標(biāo)記物HPV E6*I mRNA表達(dá)以及p16，pRb，p53和Cyclin D1蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，每個(gè)標(biāo)記物都有優(yōu)點(diǎn)和局限性[2]。

但p16的表達(dá)異常可能與兩種方式有關(guān)：(1)細(xì)胞自身基因組突變；(2) HPV-E7蛋白引起p16蛋白異常表達(dá)，同時(shí)HPV-E6蛋白會(huì)引起p53的異常表達(dá)[3]。因而在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中已將HPV作為一項(xiàng)病因?qū)W、臨床病理及分子機(jī)制的研究證據(jù)，雖然只有很少一部分口腔鱗狀細(xì)胞癌由HPV引起[4]。基于以上情況考慮，最新的頭頸部腫瘤的第八版AJCC手冊和NCCN.2.2019指南已將HPV及p16作為分類口腔癌的明確因素。我們的研究通過評估p16、p53在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)初步評估其與臨床病理特征的關(guān)系，來預(yù)測是否存在HPV感染。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中p16、p53的表達(dá)情況，分析相關(guān)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科確診的2014年8月至2018年8月口腔鱗狀細(xì)胞癌組織及臨床資料41例。

1.2 病例收集

通過收集病人病歷和隨訪獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，隨訪采用電話采訪和信訪方式。收集的信息包括：姓名、性別、年齡等基本情況，腫瘤臨床分期、分化程度等，根據(jù)2018第八版AJCC頭頸部腫瘤分期手冊進(jìn)行臨床評價(jià)分期。病人跟蹤隨訪截止時(shí)間為2018年8月30日。以上經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.3 方法與結(jié)果判定

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法

抗體：兔抗人p16抗體、兔抗人p53抗體。(BIOSS公司)

試劑盒：二步法免疫組化檢測系統(tǒng) (2-step plus Poly-HRP Anti-Mouse/Rabbit IgG Detection System，PV-9000) 和DAB檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3.2 結(jié)果判定方法

(一)陽性結(jié)果：p16陽性信號為黃色或者棕黃色，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，p53陽性信號呈棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞核。

(二)高倍鏡下(x400)對每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野。結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)為：弱陽性(+)：陽性瘤細(xì)胞占5%-10%，陽性(++)：陽性瘤細(xì)胞占10%-50%，強(qiáng)陽性(+++)：陽性瘤細(xì)胞占＞50%，陰性(—)：陽性瘤細(xì)胞占0%-5%。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用卡方檢驗(yàn)和連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)分析p16、p53與口腔鱗狀細(xì)胞癌主要臨床病理特征的關(guān)系。

表2 p16、p53蛋白表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌主要臨床病理特征的關(guān)系

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

圖1 p16、p53在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

p16、p53相關(guān)性及與41例口腔鱗狀細(xì)胞癌病例主要臨床病理特征的關(guān)系。

表1 p16與p53表達(dá)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

2017年頭頸部腫瘤第八版AJCC手冊出版，其中口腔癌及TNM分期改動(dòng)較大，新增了許多內(nèi)容，如人乳頭瘤病毒、侵襲深度、淋巴結(jié)外擴(kuò)展等指標(biāo)用于了新的分期。因此口腔鱗狀細(xì)胞癌的分期與分級、浸潤深度、淋巴結(jié)受累情況、HPV、p16、TP53相關(guān)p21基因等已成為影響口腔鱗狀細(xì)胞癌的重要預(yù)后因素。

p16 是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白，在一些正常組織和腫瘤表達(dá)，參與Rb基因的調(diào)控制細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)化[5]。而p53則是腫瘤抑制基因，它編碼53KD的p53核蛋白參與細(xì)胞生長調(diào)控[6]。許多人類癌瘤都有p53基因突變[7,8]，與野生型不穩(wěn)定p53蛋白相比，突變型p53蛋白變得穩(wěn)定促進(jìn)腫瘤分化，可以用免疫組化技術(shù)識別，而p16和p53主要表達(dá)于細(xì)胞核，通過兩者表達(dá)的組織學(xué)位置我們可以確定腫瘤的浸潤深度。

而我們關(guān)注的HPV相關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌分為兩類：1.在HPV陰性致癌的早期階段，染色體9p、3p和17p84的頻繁損失，尤其是腫瘤抑制基因TP53(編碼p53)和細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑2A(CDKN2A，編碼p16)分別位于17p13和9p21。因此p53與p16突變會(huì)引起細(xì)胞周期的異常和基因組的不穩(wěn)定性[9]。2.與之形成對比的是，HPV陽性相關(guān)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌缺乏這些染色體的異常而表現(xiàn)為野生型p53的低表達(dá)(可被HPV-E6蛋白抑制和下調(diào))和p16的過表達(dá)(HPV-E7蛋白與pRb結(jié)合干擾細(xì)胞周期后引起p16蛋白的積累)[10,11]。

Califano J等依據(jù)p16抑癌基因與p53突變型促癌基因相互作用還構(gòu)建了口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展的分子模型[9]。而Yusuke Zushi等的研究結(jié)果提供了一個(gè)HPV陽性和陰性的人口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外多步致癌模型，證明HRAS突變或EGFR激活與MYC過表達(dá)協(xié)同作用，是轉(zhuǎn)化HTK(原代人舌角質(zhì)形成細(xì)胞)的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)程序，這些HTK已通過HPV16E6E7或等效的遺傳改變獲得了pRB和p53途徑的失活以及端粒酶的激活[12]。

我們的研究采用p16、p53對相關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌的主要臨床病理特征進(jìn)行初步評估，發(fā)現(xiàn)p16與患者的患病年齡特征相關(guān)而p53則與腫瘤的分化程度相關(guān)，同時(shí)可通過建立與完善預(yù)測模型評估HPV潛在感染的可能。且已有越來越多的研究證明可通過HPV等相關(guān)因素來評估相關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后情況[13]，采用PCR、ISH等方法進(jìn)一步明確HPV的感染情況后，可為臨床診斷的路徑優(yōu)化提供一種思路。

綜上，我們通過p16、p53在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，試圖評估HPV存在潛在感染可能，對口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和預(yù)后評估提供一種新的臨床路徑，我們將進(jìn)一步檢測相關(guān)患者的HPV感染情況明確我們的研究方向。