青刺果內生真菌PUR-01的分離?鑒定及抗性評價

鄭鵬 張玥 寇燦

摘要 從青刺果植株中首次分離得到菌株PUR-01，并對其進行分離純化、抗性評價、形態學分析及分子生物學鑒定，探討該菌株對2種熱帶作物病原真菌的抑菌活性研究。結果表明，青刺果內生真菌PUR-01對橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc）均有一定的抑制作用，抑菌率分別為34%和24%，為進一步開展該菌株生防作用機理及應用研究提供基礎。通過形態學及分子生物學鑒定，該菌為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌。

關鍵詞 青刺果;內生真菌;分離;鑒定;抗性評價;橡膠樹膠孢炭疽病菌;香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型

中圖分類號 Q93文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）08-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Isolation，Identification and Resistance Evaluation of Endophytic Fungi PUR-01 from Prinsepia utilis Royle

ZHENG Peng，ZHANG Yue，KOU Can （Lijiang Teachers College，Lijiang，Yunnan 674100）

Abstract The strain PUR-01 was isolated for the first time from the Prinsepia utilis Royle plant，and it was isolated and purified，resistance evaluation，morphological analysis and molecular biological identification were carried out to explore the antibacterial activity of this strain against two tropical crop pathogenic fungi.The result showed that the endophytic fungi PUR-01 had certain inhibitory effects on Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，the inhibition rates were 34% and 24%，respectively.It provided the basis for research on biocontrol mechanism and application of endophytic fungi.By morphological and molecular biological identification，the strain was caused by Alternaria alternata.

Key words Prinsepia utilis Royle; Endophytic fungi;Isolation;Identification;Resistance evaluation;Colletotrichum gloeosporioides;Fusarium oxysporum f.sp.Cubense

青刺果（Prinsepia utilis Royle）為薔薇科扁核木屬（Prinsepia Royle）多年生落葉灌木[1]。青刺果果仁可以榨油，青刺果油中不飽和脂肪酸的含量較高[2]，符合人體代謝的生理需求，是一種綠色健康的食用油;另外，青刺果油與皮膚之間有良好的親和性，因此，青刺果油是一種重要的天然護膚油脂[3]。

植物內生真菌（endophytic fungi）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部，而不使宿主植物出現明顯感染病害的真菌[4]。一些植物體內的內生真菌一方面可以提供植物所需要的營養物質，另一方面可以提高宿主植物的抗病性、應對逆境環境，并可以產生與宿主植物相同或相似的活性物質[5-7]。截至目前，國內外對青刺果內生真菌的相關研究尚屬空白，該研究從青刺果莖段及葉片中分離出對2種熱帶作物重要植物病原真菌具有一定抑菌活性及耐鹽特性的內生真菌PUR-01。因青刺果全株均可入藥，并具有活性、祛瘀、接骨消腫等功效，青刺果油還對防止高血壓、治療糖尿病、防止心血管疾病都有較好的效果[3]，因此，研究青刺果內生真菌具有十分重要的意義。該研究旨在為今后進一步開發利用青刺果內生菌資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc），均由麗江師范高等專科學校提供。培養基：馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA）用于內生真菌的分離、馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）用于內生真菌液體發酵。

1.2 方法

1.2.1 青刺果內生真菌的分離和純化。選取新鮮健康青刺果葉片和莖段，將青刺果葉、莖段用流水沖洗1 h，晾干放入干凈的燒杯中，用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用0.5%新潔爾滅溶液浸泡20 min，無菌水沖洗3次，最后一次沖洗的無菌水留下備用。用無菌濾紙將青刺果葉片和莖段水分吸干后，加10 mL無菌水進行研磨，取1 mL左右的研磨液涂布在PDA平板上，靜止2 min，隨后倒置放于28 ℃培養。待觀察到平板上菌落長出，采用平板劃線法進行分離和純化。直至得到純菌株并將其接種到斜面PDA培養基上，液體石蠟密封并于4 ℃進行保存。

消毒可靠性設置：①將最后一次沖洗材料的無菌水1 mL涂布到PDA平板上，靜止2 min，倒置放于相同條件下進行培養，觀察結果。②參照組織印跡法[8]，將滅菌好的青刺果葉片、莖段各1片壓入PDA平板內，使滅菌材料與PDA培養基密切接觸30 min后，移去葉片和莖段。倒置于28 ℃培養。

1.2.2 青刺果內生真菌PUR-01抑菌活性初篩及復篩。

1.2.2.1 內生真菌抑菌活性初篩。將內生真菌PUR-01、供試菌株活化后，用打孔器分別打出菌餅（0.9 cm×0.9 cm），在無菌條件下，將內生真菌PUR-01菌餅接種于培養皿中央，供試菌株橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc）分別接種于青刺果內生真菌PUR-01兩側，間隔2～3 cm，每個培養皿接種相同的供試菌株2塊，置于28℃培養7 d。每個處理重復3次。

1.2.2.2 內生真菌抑菌活性復篩。在無菌條件下用接種針挑取青刺果內生真菌 PUR-01 少量菌絲接種于100mL發酵液（PDB培養基）中進行發酵，發酵條件設置：搖床轉速180 r/min，發酵培養的溫度為恒溫25 ℃，時間為6 d。

待PDA培養基溫度降低至50～60 ℃時，將上述1mL發酵濾液與9mL融化的 PDA 培養基混勻，倒入無菌培養皿內，制成平板。待培養基凝固后，在每個培養基平板上接入1個供試菌株菌餅（直徑為9 mm），使帶菌絲的一面貼在培養基表面，將平板置于25℃培養72 h。以無菌水為對照，每處理 3 次重復，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算抑制率[9]：菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100%。

1.2.3 青刺果內生真菌PUR-01形態學鑒定。參照載玻片培養觀察法[10]。

1.2.4 青刺果內生真菌PUR-01分子生物學鑒定及系統進化樹構建方法。

挑取青刺果內生真菌 PUR-01 少量菌落接種于20 mL PDB培養基中，25 ℃、180 r/min 搖床培養5 d。真菌DNA根據真菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取，真菌ITS序列PCR擴增使用通用引物 ITS1和ITS4（ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′; ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。根據測序結果，在美國國立生物技術信息中心NCBI GenBank數據庫中進行BLAST分析，用ClustalX軟件進行多序列比對（multiple alignments），并用Mega軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 青刺果內生真菌PUR-01分離純化

通過可靠性檢驗，未發現有菌落長出。說明該試驗對青刺果外植體的消毒是徹底的。通過培養，從含有研磨液的PDA平板上用平板劃線法不斷分離、純化，最終獲得青刺果內生真菌PUR-01。

2.2 青刺果內生真菌PUR-01抑菌活性初篩及復篩

以平板對峙法初步檢測青刺果內生真菌PUR-01對供試2種熱帶作物病原真菌菌株的抑菌活性，從圖1可以看出，青刺果內生真菌PUR-01對供試的香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型抑菌活性較為明顯，而對橡膠樹膠孢炭疽病菌抑菌活性不明顯;結果表明，青刺果內生真菌PUR-01對供試的香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型具有明顯的拮抗性。為進一步評價青刺果內生真菌PUR-01的抑菌活性，采用菌絲生長速率法[9]進行復篩，從表1可以看出，青刺果內生真菌PUR-01對橡膠樹膠孢炭疽病菌和香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型的抑制率分別為34%、24%，由此可知，青刺果內生真菌PUR-01對2種熱帶作物病原真菌都具有一定的抑菌活性，但抑菌活性均比較低。

2.3 青刺果內生真菌PUR-01形態學鑒定

從圖2可以看出，青刺果內生真菌PUR-01菌落表面為絨狀，圓形，黑色至灰色，同心輪紋。菌落背面黑色至灰色。基內菌絲發達，有隔，菌絲單生或分枝。分生孢子鏈生，卵形或長橢圓形，黃褐色，分子孢子橫隔膜3～6個，縱或斜隔膜0～2個，短喙柱狀。參照《真菌鑒定手冊》[11]，將青刺果內生真菌PUR-01初步鑒定為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌。

2.4 青刺果內生真菌PUR-01分子生物學鑒定及系統發育分析 通過18S rDNA的ITS序列進行PCR擴增，回收產物純化后送上海生物工程公司測序。將測序結果導入到NCBI進行Blast比對，采用MEGA 6.06軟件用Neighbour-joining法構建系統發育樹，參數設置如下：Bootstrap method重復抽樣次數為1 000;Gaps/Missing Data Treatment 采用Pairwise deletion模型，得到圖3。從圖3可以看出，該菌的ITS序列和Alternaria alternata strain（基因登錄號KR912224.1）、Alternaria alternata strain（基因登錄號KX783397.1）聚為一簇，結合該菌的形態特征，認為該菌為半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科、鏈格孢屬（Alternaria alternata）。

3 討論與結論

青刺果作為一種特殊的油料植物越來越受到麗江市人民政府的重視，青刺果因其全株可以入藥一直被納西族所利用，其嫩尖還可以泡茶或做涼拌菜。研究表明，青刺果多糖對糖尿病小鼠肝臟具有保護作用[12];青刺果種粕粉乙酸乙酯提取物通過柱層析后抑菌活性大大提高[13]，青刺果油還具有調節血脂、抑制血小板聚集、抗氧化、護膚等作用[14-18]。目前，研究藥用植物內生真菌并從中發現具有活性成分和結構新穎的化合物已成為研究熱點[19-21]。青刺果作為一種兼藥用和食用的特殊植株，對其內生真菌的分離及應用存在空白。該試驗通過對青刺果內生真菌的分離，并用2種重要熱帶作物病害為病原指示菌，發現分離的內生真菌PUR-01對2種供試菌具有一定的抑菌活性但抑菌活性都不強;通過形態學及分子生物學鑒定，該菌為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌，這也是首次從青刺果莖葉中分離到的真菌。鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌是一種常見的可引起作物病害的病原菌，在全球分布最廣，95%以上的種類都兼性寄生在植物上，為潛在的病原菌[22-24]。此外，鏈格孢屬真菌也是一類具有開發潛力的生物資源，其代謝產物具有殺蟲、殺菌的作用，能夠提高植物自身免疫力，對多種植物病害有較高的防效[25]。

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