枸杞多糖提取工藝優化及其單糖組成測定

吳佳欣，馬 良，陳 騰，李文建，萬鳳奇，3

1 蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2 中國科學院近代物理研究所；3 蘭州大學第二醫院

枸杞（Lycium barbarumL.）為茄科枸杞屬落葉灌木植物，主要分布在我國西北地區，是傳統名貴中藥材［1-2］。《本草綱目》中記載：“枸杞，補腎生精，養肝，明目，堅精髓，去疲勞，易顏色，變白，明目安神，令人長壽”［3］。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是一種從枸杞子中提取的水溶性多糖，具有多種生物活性，如：提高免疫力［4］，保護視網膜神經［5］，降血糖［6］，抗氧化［7］，保護骨骼［8］等。因此，LBP的研究與開發具有重要的意義。熱水提取法是提取多糖常用的方法，近年來相繼發展出了酶解提取法、超聲助提法、超臨界流體萃取法等新方法。與熱水提取法相比，這些方法在提取率方面有了一定的提高，但是同時也存在一定弊端［9-10］：酶解提取法提取成本高，且提取條件嚴格，一般在酸堿環境下提取，增加了工業化生產后廢液處理等工序的復雜性；超聲提取法的設備價格昂貴，并且長時間的超聲提取將導致可溶性多糖降解，其產生的機械效應和空化效應具有較強的破壞性，這可能對多糖的天然構象產生影響甚至破壞其活性中心；超臨界流體萃取法等新技術尚處于初步探索階段，目前還無法實現工業化上大規模的應用。相比之下，熱水提取法具有經濟、安全的特點，且極大地保留了LBP 的天然構象和活性，不僅適用于工業化生產，還有利于進一步的生物學活性的研究，故本研究選擇了熱水提取法進行優化。傳統優化熱水提取條件的方法是固定其他參數，每次只對單一變量進行研究，這種研究方法的效率極低，且無法準確說明不同因素之間的相互作用關系。響應面法采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析尋求最優工藝［11］。相較于傳統方法，響應面法的試驗周期短，且能夠準確可靠地預測最佳工藝條件［12］，目前已廣泛應用于食品、化學、農業、生物等領域［13-17］。從枸杞中提取得到的LBP 是一種結構復雜的復合多糖，組成單糖主要有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖及半乳糖醛酸等［18］，根據枸杞來源的不同，其主要單糖組成種類和比值各不相同［19-20］。HPLC是分析糖類組成的重要方法，通常使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）在溫和條件下與糖進行柱前衍生化反應，使其帶上發色基團，從而易被紫外檢測器所檢測。該法操作便捷、準確度高，目前已被廣泛應用于各種糖類化合物的分析［21-22］。

因此，筆者基于甘肅豐富的枸杞資源，采用響應面的方法研究了提取時間、液料比和溫度對LBP 提取率的影響，從而對提取條件進行優化。同時，使用柱前衍生化HPLC 法測定LBP 的單糖組成，為LBP的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料枸杞干果（甘肅鼎鑫農業科技有限公司）。甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖（Sigma-Aldrich 公司，批號分別為：WXBC8934V、BCBL0552V、BCBS0769V、BCBV6690、WXBC6480V、WXBC6621V）；乙腈、甲醇（質譜純，Thermo Fisher 公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氟乙酸、PMP、丙酮、三氯甲烷、濃硫酸、苯酚（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；試驗用水為超純水。

1.2 儀器DionexUltiMate 300 型超高效液相色譜儀（Thermo 公司）；N-1100 型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；3-5N 型離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；粉碎機；電熱恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的提取 將枸杞干果置于烘箱中60℃干燥12 h 后，進行粉碎，研磨，過篩。稱取枸杞粉末10 g，按一定液料比加入蒸餾水，加熱提取一定時間后，離心，收集上清液，并將上清液進行抽濾，棄去殘渣。將過濾后得到的溶液旋轉蒸發，濃縮至50 mL 左右，加入95%乙醇200 mL，于4℃冰箱中靜置12 h，抽濾，依次用丙酮、乙醇洗滌2～3次，干燥后得LBP。稱質量，計算LBP產率［23］。

1.3.2 單因素試驗 選擇提取時間、液料比、溫度三個因素，以提取產率為衡量指標，進行單因素試驗。提取條件為：固定液料比為30∶1，在80℃下分別提取1、2、3、4、5、6、7 h，考察提取時間對LBP提取率的影響；固定提取時間為3 h，以液料比分別為 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1，在80℃下提取3 h，考察液料比對LBP 提取率的影響；固定液料比為30∶1，分別在60、70、80、85、90、95、100℃下提取3 h，考察溫度對LBP 提取率的影響。

1.3.3 響應面設計 在單因素試驗的基礎上，采用 Design Expert 軟件，根據 Box-Benhnken 的原理進行試驗設計。在LBP 提取單因素基礎上，以提取時間（X1）、液料比（X2）和溫度（X3）為自變量，LBP 得率（Y）為響應值，進行3 因素 3 水平的響應面分析。響應面優化回歸分析模型為（其中，β0、βi、βii、βij為截距及回歸系數，Xi和Xj為自變量）：

1.3.4 LBP 的水解及衍生化 稱取10 mg LBP，加入2 mol/L 三氟乙酸5 mL，于烘箱中100℃酸水解3 h。將溶液旋干，加入甲醇洗滌、旋干至中性。將殘渣溶于5 mL 水，混勻。移取200 μL 離心管中 ，加入 0.05 mol/L 的 PMP 甲醇溶液 200 μL 和0.3 mol/L NaOH 溶液 200 μL，置于 70℃烘箱中反應 60 min，冷卻至室溫，加入 0.3 mol/L 的 HCl 溶液200 μL 進行中和。用氯仿萃取過量的PMP，重復3次。收集上清液，過0.45 μm濾膜，待測。

1.3.5 HPLC色譜條件 色譜柱為Thermo Scientific Hypersil GOLD（250 mm×4.60 mm，5 μm），流動相為乙腈：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為6.8）=17∶83，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測波長245 nm，進樣量20 μL。

1.4 統計學方法響應面試驗采用Design Expert 8.0.6 軟件設計，實驗設置重復3 次以上（n≥3）。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1 時間對LBP 產率的影響 在1～4 h 內，隨著提取時間增加，多糖在水中的溶解增加，從而產率上升；當提取時間達到4 h 后，多糖產率反而有略微的下降，分析原因，可能是由于長時間的加熱引起了多糖的降解［24］。見圖1A。

2.1.2 液料比對LBP產率的影響 在20∶1至35∶1內，隨著液料比提升，LBP 在水中的溶解有所增加，使得產率具有緩和的增長，當超過40∶1 后，再增加液料比產率反而有所下降，分析原因，可能是溶劑的增加影響了浸提體系的傳熱和傳質，不利于多糖的提取［25］。見圖1B。

2.1.3 溫度對LBP 產率的影響 在60～85℃，產率隨著溫度升高具有明顯增長，在85～95℃，曲線的變化較為平緩，達到100℃時，多糖產率有所下降，分析原因，可能是過高的溫度使得LBP 容易發生分解［26］。見圖1C。

圖1 不同因素對LBP提取產率的影響

2.2 響應面優化LBP 提取條件的研究綜合單因素試驗的結果，以提取時間（X1）、液料比（X2）、溫度（X3）3 個因素為自變量，以LBP 提取率（Y）為響應值，設計響應面試驗分析方案，包括12 個析因實驗和5 個中心試驗。響應面分析因素與水平取值見表1，試驗設計和試驗結果見表2。

表1 響應面分析因素與水平

表2 試驗設計和試驗結果

利用Design Expert軟件，對響應值與3個因素進行回歸擬合，得到Y對X1、X2、X3的三元二次回歸方程為：

回歸模型的決定系數R2=0.9834，說明響應值的變化有98.34%來自于所選變量。變異系數值C.V.=1.36%，表明了試驗值具有非常高的可靠性。對回歸模型進行方差分析，結果如表3 所示。回歸項F 值=46.10，P＜0.0001，說明所選模型高度顯著［27］。各因素中，一次項、二次項系數P值均小于0.05。結果表明，提取時間（X1）、液料比（X2）、溫度（X3）與LBP 的產率（Y）顯著相關，其順序為提取溫度＞液料比＞時間。見表3。

表3 回歸模型方差分析

2.3 響應面分析的3D圖響應面分析的3D曲面圖和等高線圖，見圖2。由圖2A 和圖2D 可以得出，產率Y隨著X1從 3 增加到 3.915 而增加，而之后則隨著X1的增加而降低；同理，Y分別在X2、X3為36.633和93.195時達到最大值。可以得出，當X1=3.915，X2=36.633，X3=93.195 時 ，Y達 到 最 大 值4.288%。結合實際情況，將最佳提取條件調整為提取時間（X1）為3.9 h，液料比（X2）為36.6∶1，溫度（X3）為93.2℃。在此條件下，實際測得提取率為4.28%，比理論值低0.2%，與模型預測值較為接近，說明用響應面法優化LBP 提取條件的參數可靠。見圖2。

2.4 LBP單糖組成測定

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 線性范圍 精密稱取一定量的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 種單糖標準品，置于100 mL 容量瓶定容，配制成濃度分別為48.50、51.30、144.90、301.35、290.08、384.28 μg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液適量，用水稀釋成系列溶液，PMP 衍生化后按照“1.3.5”項下色譜條件進行測定。以單糖峰面積的對數為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性考察。見表4。

2.4.1.2 儀器精密度 取對照品溶液PMP 衍生化后，按照“1.3.5”項下色譜條件，連續進樣6 次，對6 種單糖的峰面積值進行測定，計算得其相對標準偏差分別為0.50%、0.11%、0.71%、0.22%、0.30%、0.18（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.1.3 重復性試驗 平行配制供試品6 份進行PMP 衍生化后，按照“1.3.5”項下色譜條件進行測定，計算得其相對標準偏差分別為3.25%、3.50%、4.24%、3.44%、3.97%、4.61（n=6），表明方法重復性良好。

2.4.1.4 穩定性試驗 取對照品溶液衍生化后，按照“1.3.5”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、10、12 h 進行測定，計算得其相對標準偏差分別為0.60%、1.23%、3.92%、2.37%、4.13%、2.33（n=6），表明溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.2 HPLC 分析 LBP 的柱前衍生化 HPLC 測定結果見圖3、表5。可以得出，LBP 由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 種單糖組成，其含量比為 4.98∶2.93∶8.38∶22.44∶25.38∶35.89。其中，阿拉伯糖含量最高，葡萄糖和半乳糖含量次之，而半乳糖醛酸、甘露糖和鼠李糖的含量較低，這與先前相關研究報道中LBP 的組成［28-29］相近。

圖2 響應面分析的3D圖

表4 6種單糖的線性范圍

圖3 LBP的柱前衍生化HPLC測定結果

表5 LBP單糖組成的測定結果

3 討論

熱水提取法作為多糖提取最常用的方法，具有經濟安全、易于工業化生產的特點，且極大地保留了LBP 的天然構象。因此，本實驗采用水提法提取枸杞中的多糖，并分析其單糖組成。在單因素試驗的基礎上，應用Design expert 軟件，采用Box-Benhnken 試驗設計對LBP 進行響應面分析，得到LBP提取產率最優的條件為：提取時間3.9 h，液料比36.6∶1，溫度93.2℃，此時產率為4.28%，與模型預測值接近，說明用響應面法優化LBP 提取條件的參數可靠。依據文獻中對LBP 單糖組成的報道［30］，采用柱前衍生化 HPLC 法對 LBP 組分進行測定，結果表明其由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 種單糖組成，而未檢測出木糖。6 種單糖含量百分比為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=4.98∶2.93∶8.38∶22.44∶25.38∶35.89。