柴胡加龍骨牡蠣湯“異病同治”冠心病和焦慮癥的網絡藥理學作用機制

靳會會，黃樂曦，侯季秋，陳雅麗，史金玉，安 瑩，趙海濱

隨著生物-心理-社會醫學模式的建立，情志因素在疾病發生發展中的重要作用逐漸受到重視。冠心病是公認的心身疾病，焦慮癥狀或焦慮癥顯著增加冠心病的發生風險[1]，影響治療及預后，兩者病理互損，導致惡性循環。“雙心”異常已逐漸成為冠心病的重要發病形式和國內外心血管病學界的研究熱點[2]。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，由柴胡、黃芩、人參、茯苓、桂枝、半夏、大黃、龍骨、牡蠣、大棗、鉛丹(現由珍珠母代替)、生姜12味藥組成，是治療情志類疾病的經典方劑。近年來藥理研究及動物實驗表明，柴胡加龍骨牡蠣湯治療雙心疾病療效確切，該方不僅能干預動脈粥樣硬化，對兒茶酚胺所致的心血管損傷具有保護作用，還可逆轉下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸亢進、修復應激導致的海馬神經元損傷，并通過調節中樞神經發揮抗焦慮等作用[3-5]，對心臟的生理功能和病理狀態均產生一定的影響。柴胡加龍骨牡蠣湯成分復雜，現有研究多局限于單一靶點和通路，治療冠心病和焦慮癥共病的作用機制研究尚不明確。本研究應用網絡藥理學方法，從分子角度分析柴胡加龍骨牡蠣湯的活性成分靶點與疾病之間的關聯性，構建活性成分、靶點、疾病、通路之間的多種網絡關系，旨在為臨床研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分與靶點預測 檢索TCMSP數據庫[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18和藥物對小腸上皮細胞的穿透性(Caco-2)≥0.4為條件，初步篩選柴胡加龍骨牡蠣湯植物藥(柴胡、黃芩、人參、茯苓、桂枝、半夏、大黃、生姜、大棗)的活性成分及對應的靶點信息，并根據已發表的文獻補充未預測到的活性成分的已知靶點。登錄BATMAN-TCM數據庫[7](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)獲得礦物藥(龍骨、牡蠣、珍珠母)可信度高的蛋白作為候選靶點。通過Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)將上述預測靶點進行校正和轉化操作，最終獲得柴胡加龍骨牡蠣湯活性成分的靶點信息。

1.2 疾病靶點篩選 利用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，以“coronary heart disease”“anxiety disorder”為關鍵詞檢索與冠心病和焦慮癥相關的靶點。將上述成分靶點與疾病靶點進行匹配，分別獲得柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥的潛在作用靶點，通過Venn diagram在線程序繪制韋恩圖進行分析。

1.3 靶蛋白相互作用網絡構建 將柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥的共有靶點導入STRING平臺(https://string-db.org/)進行蛋白分析，限定物種為“homo sapiens”，選擇置信度為0.400，其余參數保持默認設置，結果以TSV格式導出，根據分析結果統計靶點關聯頻次，得到核心靶點信息。其中網絡的粗細代表相互作用強弱，靶點的度值表示相互作用的靶點個數。

1.4 靶點通路注釋分析 為較好地了解核心靶點的功能及在信號通路中的作用，利用R語言的org.Hs.eg.db程序包，將基因symbol轉化為基因ID，之后安裝colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程序包，對獲取的基因分別進行基因本體(GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設定閾值P<0.05。按照涉及的靶點數量進行排序，繪制柱狀圖和點圖。

1.5 活性成分-靶點-通路網絡構建 利用Cytoscape 3.7.1軟件(http://www.cytoscape.org/)構建活性成分-靶點-通路共表達網絡，借助Network Analyzer功能對網絡的拓撲性質進行分析，研究基于自由度、緊密度、介度中心性等參數以評估節點在網絡中的重要性。

1.6 分子對接驗證 分子對接是分子通過能量、化學環境等相互識別找到最佳匹配模式的過程。采用Auto Dock vina軟件對PPI網絡中度值居前3位的靶蛋白與柴胡加龍骨牡蠣湯主要活性成分進行分子對接，從Chem Office軟件和RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)分別獲得化合物和靶蛋白的3D結構，利用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、加氫等處理，借助Auto Dock軟件將化合物和靶蛋白格式轉化為＊pdbqt格式，最后通過Vina進行對接。根據結合能值評估化合物與靶蛋白的結合強度與活性。

2 結 果

2.1 活性成分及靶點獲取 經TCMSP數據庫篩選得到植物藥活性成分共102個，其中柴胡9個，黃芩29個，茯苓5個，人參17個，桂枝3個，大黃5個，半夏10個，生姜5個，大棗19個。通過BATMAN-TCM數據庫，在Score cutoff>20條件下，得到礦物藥活性成分共7個。將上述兩個數據庫所得活性成分預測產生的靶點合并去重后獲得靶點175個。

2.2 疾病相關靶點獲取 從GeneCards數據庫得到冠心病相關靶點6 567個，焦慮癥相關靶點2 887個，確定疾病共有靶點1 380個。將柴胡加龍骨牡蠣湯活性成分靶點與兩種疾病共有靶點取交集，利用Venn diagram軟件繪制韋恩圖，得到活性成分-疾病共有靶點92個，詳見圖1。將共有靶點與活性成分匹配后發現74個有效活性成分參與調控92個作用靶點，其中豆甾醇為柴胡、黃芩、人參、半夏、生姜、大棗共有化合物；黃芩素為黃芩與半夏共有化合物；谷甾醇為黃芩與桂枝共有化合物等，提示柴胡加龍骨牡蠣湯中相同的化合物對應多種不同藥材，多個靶點可對應相同化合物，初步推測上述結果可能是柴胡加龍骨牡蠣湯發揮“異病同治”功效的關鍵。74個有效活性成分信息詳見表1。

圖1 柴胡加龍骨牡蠣湯與冠心病、焦慮癥交集靶點韋恩圖

表1 柴胡加龍骨牡蠣湯有效活性成分信息

(續表)

2.3 靶蛋白PPI網絡分析及核心靶點結果 將共有靶點上傳至STRING平臺，隱藏4個游離的無相互作用蛋白，進而得到由88個靶蛋白參與的PPI網絡，詳見圖2。該網絡包含88個節點、412條邊，其中紫色線代表經過實驗驗證的蛋白間相互作用，淺藍色線代表從數據庫中獲得的蛋白間相互作用。分析網絡中參數信息，將自由度排名居前30位的節點進行統計及可視化處理，結果提示靶標中度值排名居前5位的分別為蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、白細胞介素6(IL-6)、轉錄因子AP-1(JUN)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素8(CXCL8)。自由度作為關鍵的拓撲特征值之一，表示與某點連線的邊的數量，度值越大說明該靶點與更多的靶標存在靶向聯系，因此在網絡中的作用也越重要，核心靶點柱狀圖詳見圖3。

圖2 靶蛋白相互作用網絡圖

圖3 核心靶點柱狀圖

2.4 靶點功能與通路富集分析 借助R語言對92個交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，根據P<0.05選取排名居前20位的條目進行分析。GO分析確定了118個生物學過程相關的條目，主要涉及蛋白異源二聚化活性、離子跨膜轉運蛋白活性、G蛋白偶聯胺受體活性、神經遞質受體活性、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合、類固醇結合、核受體活性、類固醇激素受體活性等，詳見圖4。KEGG通路分析結果顯示：神經活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導、鈣信號通路、絲裂原活化蛋白激酶B(MAPK)信號通路、IL-17信號通路、5-羥色胺能突觸、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)信號通路、cGMP-PKG信號通路、環磷酸腺苷(cAMP)信號通路等在柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥共病過程中均發揮著重要作用，詳見圖5。

圖4 柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病合并焦慮癥共有靶點的GO生物過程

圖5 柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥共有靶點的KEGG通路富集分析

2.5 活性成分-靶點-通路網絡的構建 利用Cytoscape 3.7.1軟件構建活性成分-靶點-通路網絡圖，詳見圖6，借助其插件Network Analyzer進行分析。該網絡包括186個節點和982條邊，深綠色節點代表靶點，粉色節點代表活性成分，紫色節點代表通路，網絡節點大小與自由度呈正相關，節點越大表明度值越高。網絡分析表明，β-谷甾醇自由度為140，緊密度為0.421 2，介度為0.076 4，因此，預測β-谷甾醇是柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥共病的主要活性成分，其次為豆甾醇(自由度為108，緊密度為0.402 6，介度為0.086 5)、黃芩素(自由度為30，緊密度為0.380 7，介度為0.049 8)，詳見表2。從靶點角度分析，度值較大的靶點包括PTGS2、SCN5A、NCOA2、ADRB2、ADRA1B、CASP3、BCL2等，可能是柴胡加龍骨牡蠣湯發揮作用的主要靶點。該網絡圖表明柴胡加龍骨牡蠣湯通過多成分、多靶點、多通路協同調控而發揮“異病同治”的作用。

表2 柴胡加龍骨牡蠣湯主要活性成分的拓撲屬性參數

圖6 活性成分-靶點-通路網絡圖

2.6 分子對接結果 將PPI網絡中度值排名居前3位的靶蛋白與柴胡加龍骨牡蠣湯主要活性成分進行分子對接驗證，詳見表3。當結合能<0說明配體和受體可自發結合，結合能<-5 kcal/mol，表示有較好結合活性，結合能分值越低對接效果越佳[8]。分子對接結果顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯的主要活性成分β-谷甾醇、黃芩素與3個靶蛋白的對接親和力均<-5 kcal/mol，表明篩選出的活性成分與靶蛋白均能較好的結合，其中β-谷甾醇與受體AKT1的結合活性最強，詳見圖7。

表3 柴胡加龍骨牡蠣湯主要活性成分與核心靶點的結合度

3 討 論

近年來，雙心醫學日益受到重視，心臟合并心理異常“雙心”疾病常互為因果，冠心病與焦慮癥共病的病人當以“雙心同治”為治療原則[9]。中醫學認為冠心病屬“胸痹”“心痛”范疇，焦慮癥屬“郁證”范疇。《內經》中已記載“心主血脈”與“心主神明”的雙心理論，而中醫“形神合一”與“雙心醫學”理念不謀而合。中醫藥治療雙心疾病療效確切，尤其改善癥狀方面具有極大潛力。王克鵬[10]通過臨床試驗證實采用柴胡加龍骨牡蠣湯聯合常規西藥治療穩定型心絞痛伴焦慮，治療后病人胸痛、胸悶癥狀積分升高，同時焦慮癥狀顯著減輕，療效優于對照組，顯示出安神除煩的功效。許國磊等[11]研究顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯加減治療的治療組焦慮評分、生活質量評價指標、療效等均優于對照組。本課題組前期研究發現，柴胡加龍骨牡蠣湯能改善病人心絞痛癥狀，緩解焦慮狀態；促進心肌梗死大鼠骨髓間充質干細胞動員、歸巢及旁分泌，抑制炎癥反應和心肌梗死后交感重構，從而改善心肌梗死后心肌損傷及焦慮程度[12-13]。

本研究采用網絡藥理學方法初步篩選出柴胡加龍骨牡蠣湯治療冠心病和焦慮癥共病的主要活性成分包括β-谷甾醇、黃芩素、谷甾醇、黃連素、人參二醇等。有研究顯示，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎癥、降低膽固醇、調節中樞神經系統、免疫調節和抗腫瘤等作用[14]。黃芩素預處理可能通過激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路和抑制氧化應激反應，對急性心肌梗死產生心臟保護作用[15]。黃芩素抗氧化應激和抗炎的機制主要通過改善超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的抗氧化酶活性，減少活性氧(ROS)和丙二醇產生，抑制白細胞介素1(IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)1等炎性因子表達[16]。Yadav等[17]研究發現，豆甾醇能明顯減少氯胺酮誘發的小鼠自發活動、刻板行為及潛伏期等精神病癥狀，增加γ-氨基丁酸和谷胱甘肽水平，降低多巴胺、丙二醛、TNF-α水平和乙酰膽堿酯酶活性，顯示出豆甾醇對精神病癥狀有一定的改善作用。

冠心病和焦慮癥具有AKT1、IL-6、JUN等92個共有靶點，74個活性成分，121條共同通路，冠心病與焦慮癥相似的作用功效是柴胡加龍骨牡蠣湯對兩個不同系統疾病“異病同治”的作用基礎。PPI網絡分析發現各靶標之間關聯密切，自由度越大表明該靶點在網絡中參與調控的可能性越大，預測到共有靶點是冠心病和焦慮癥治療的重要靶點。AKT1、IL-6、JUN是PPI網絡中度值排名較高的關鍵靶點，分子對接證實這3個受體蛋白與β-谷甾醇、黃芩素具有較好的結合活性。AKT1是3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的亞型(AKT1、AKT2、AKT3)之一，處于多條信號通路的交叉點，通過影響下游多種因子活化，介導細胞存活、增殖與凋亡、新生血管形成、動脈粥樣硬化及細胞周期調控等多種生理過程[18-19]。IL-6是一種炎性因子，主要由活化的成纖維細胞和T細胞產生，參與炎癥反應。IL-6通過與其他促炎因子形成級聯反應，是冠心病的獨立危險因素[20]。相關研究發現，焦慮、抑郁病人IL-1、IL-6和C反應蛋白等炎性因子水平較對照組升高，免疫炎癥反應增強[21]。JUN蛋白(v-Jun、c-Jun、JunB和JunD)是核轉錄因子AP-1家族的成員，AP-1復合物典型結構是由c-Fos與c-Jun結合形成的異源二聚體，AP-1與DNA結合后調控多種基因的表達，主要通過調節VEGF誘導內皮細胞遷移、增殖與血管生成[22-23]。神經元凋亡過程中JNK/c-Jun通路激活發揮著重要作用，c-Jun持續性表達和磷酸化是神經細胞凋亡所必需的，應用特異性阻斷劑阻斷JNK/c-Jun通路，結果表現出抑制凋亡的保護效應[24-25]。上述相關重要靶標的作用與分子對接結果表明，AKT1、IL-6、JUN可能是柴胡加龍骨牡蠣湯發揮藥效作用的關鍵靶點，間接驗證網絡藥理學預測結果的準確性，柴胡加龍骨牡蠣湯主要通過抗凋亡、抗炎、血管新生、調節焦慮及抗動脈粥樣硬化等作用充分體現“異病同治”的治療思想。

GO富集分析結果表明，相關作用靶點主要參與蛋白異源二聚化活性、離子跨膜轉運蛋白活性、G蛋白偶聯受體活性、神經遞質受體活性、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合、轉錄因子活性等生物學過程。KEGG富集分析發現，柴胡加龍骨牡蠣湯作用靶點富集度最高的相關通路中MAPK信號通路是生物體中重要的信號轉導通路之一，存在于多數細胞內，其在細胞增殖、分化、轉化和凋亡等過程中發揮重要的作用[26]。PI3K/AKT信號通路激活可誘導炎性細胞的聚集促進炎癥反應從而加速動脈粥樣硬化進展，AKT是PI3K信號通路下游的一個重要靶蛋白，活化的AKT通過磷酸化作用，調控下游多個靶蛋白促凋亡分子Bcl-2/Bcl-xL相關的死亡啟動因子、eNOS等，進而調節細胞增殖、凋亡、分化及遷移等[27-28]。5-羥色胺能突觸通路是由5-羥色胺和分布于腦內不同部位的突觸前后膜上各類5-羥色胺受體組成，可影響γ-氨基丁酸、多巴胺等其他神經遞質釋放，介導情感、學習、記憶、行為等大腦高級活動，其功能改變引起焦慮癥、抑郁癥和老年癡呆等情志疾病發生[29]。柴胡加龍骨牡蠣湯可調節其他多條通路，在神經活性配體-受體相互作用、內分泌抵抗、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導等方面發揮重要的作用，這與中醫藥治療的整體觀念一致，符合中藥多成分、多靶點、多通路協調治療疾病的特點。

綜上所述，本研究在生物信息學基礎上，對柴胡加龍骨牡蠣湯“異病同治”冠心病和焦慮癥的作用機制進行探討，為進一步實驗研究和臨床應用提供了新思路。本研究存在的不足：僅從理論方面對柴胡加龍骨牡蠣湯作用機制進行了預測，未明顯提示活性成分對關鍵基因表達的上調與下調關系，但未考慮藥物、靶點、疾病之間作用強度的差異，今后仍需進一步研究驗證。