子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對表達水平變化及其臨床意義*

袁 媛,韓大鵬,胡 麗

1.上海城建職業學院健康與社會關懷學院，上海 201415；2.上海光華中西醫結合醫院關節外科，上海 200000；3.上海中醫藥大學附屬曙光醫院婦產科，上海 200021

子癇前期是一種常見妊娠并發癥，在全球圍產期孕婦中其發病率為5%～8%，且呈逐步升高趨勢，每年有超過76 000例孕婦和500 000例胎兒因子癇前期死亡[1]。子癇前期發病機制復雜，遺傳、環境及心理被認為是其發病過程中的關鍵因素，隨著分子診斷技術及理論的不斷發展，微小RNA(miRNA)的表達變化或其調控通路的改變也被認為與子癇前期的發生、進展相關[2]。miRNA是一組內源性非編碼單鏈RNA分子，其長度通常為22個核苷酸，miRNA自身并不編碼蛋白質，而是通過與其他基因結合對靶基因進行調控[3]。miRNA可調控細胞分化、增殖、凋亡等過程，在機體代謝穩態、腫瘤發生及免疫等過程中發揮重要作用，惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等中均發現miRNA異常分布，miRNA在這些疾病發生過程中具有調控作用[3-5]。已有研究報道，miRNA在子癇前期患者胎盤組織中呈異常表達[6]，但胎盤組織miRNA檢測只能在產后進行，并不能預先對該病進行診斷與預判。由于miRNA可以經血液循環進入母體外周血，且在外周循環中高度穩定，使得血清miRNA可能作為無創診斷、監測子癇前期的潛在生物標志物。曾辛等[6]研究發現，miR-21在孕婦胎盤組織高表達可能與重度子癇前期發病相關。本研究主要探討血清miR-21、miR-125b的相對表達水平變化及聯合檢測的臨床意義，以期為子癇前期無創檢測、診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018 年7月至 2019 年10月在上海中醫藥大學附屬曙光醫院就診的子癇前期患者60例，根據《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[7]中關于子癇前期的診斷標準，分為輕度子癇前期患者(輕度組，28例)及重度子癇前期患者(重度組，32例)。另選擇同期體檢健康妊娠孕婦58例作為對照組。所有研究對象既往無高血壓、其他心血管疾病、糖尿病及腎臟疾病等慢性疾病史，無乙醇或藥物濫用史，無吸毒史，無前置胎盤、胎盤早剝、流產、早產等不良妊娠結局。本研究經上海中醫藥大學附屬曙光醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血壓檢測 收集3組研究對象的年齡、孕周、孕次、產次等，采用水銀血壓計(魚躍醫療)測量所有研究對象的血壓，測量前靜坐，期間禁飲濃茶、咖啡等，以3次測量結果的平均值作為最終結果。

1.2.2標本收集 每位研究對象在首次入院時采集空腹靜脈血2管，每管5 mL，其中一管不添加抗凝劑，靜置20 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃凍存備用(miRNA檢測)；另一管采用肝素抗凝，靜置10 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清-20 ℃保存備用(生化指標檢測)。收集研究對象24 h蛋白尿，以二甲苯防腐，取標本5 mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液標本-20 ℃保存備用(尿蛋白檢測)。

1.2.3生化指標及尿蛋白檢測 采用羅氏(上海)Cobas 8000全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白水平，日立7600型全自動生化分析儀檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。購買儀器配套成品試劑盒，檢測室的室內溫度、濕度、操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4血清miR-21、miR-125b相對表達水平檢測 先進行外周血中總RNA的提取，按照miRNA 提取分離試劑盒操作說明書進行；采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的濃度和純度，比值在1.8～2.0者可用于后續實驗；再將RNA 反轉錄合成cDNA，參照反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)操作說明書進行；最后進行實時熒光定量PCR(qPCR)擴增，嚴格按照GoTaqR qPCR Master Mix試劑盒操作說明書進行，每個樣品設置 3 個平行重復，內參為管家基因U6。實驗結束后記錄Ct值，使用 2-ΔΔCt公式對miRNA進行定量，計算血清miR-21、miR-125b的相對表達水平。qPCR檢測引物序列如下，miR-21上游引物:5′-TCG GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3′;miR-21下游引物:5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′。miR-125b上游引物:5′-TCC CTG AGA CCC TAA CTT GT-3′;miR-125b下游引物:5′-ACA AGT TAG GGT CTC AGG GA-3′。U6上游引物:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′;U6下游引物:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

2 結 果

2.1一般資料比較 3組年齡和孕周比較，差異無統計學意義(P>0.05)；輕度組、重度組子癇前期患者收縮壓、舒張壓均較對照組明顯升高，新生兒體質量明顯下降(P<0.05)。重度組子癇前期患者收縮壓、舒張壓明顯高于輕度組(P<0.05)，新生兒體質量明顯低于輕度組(P<0.05)。見表1。

表1 3組孕婦的一般資料比較

2.2血清miR-21、miR-125b的相對表達水平比較 3組血清miR-21、miR-125b的相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。組間比較顯示，輕度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而重度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對表達水平明顯高于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A表示miR-21的相對表達水平在3組間的比較；B表示miR-125b相對表達水平在3組間的比較。

2.3血清miR-21、miR-125b與子癇前期相關指標的相關性分析 孕婦血清miR-21、miR-125b與收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、BUN呈正相關(P<0.05)，與新生兒體質量呈負相關(P<0.05)。見表2。

2.4血清miR-21、miR-125b對子癇前期的診斷價值 ROC曲線結果顯示，血清miR-21單獨檢測診斷子癇前期的曲線下面積(AUC)為0.836(95%CI：0.762～0.910)，最佳臨界值為1.137時，靈敏度為74.1%，特異度為72.6%；miR-125b單獨檢測診斷子癇前期的AUC為0.801(95%CI：0.722～0.880)，最佳臨界值為1.408時，靈敏度為70.0%，特異度為73.5%。依據血清miR-21、miR-125b單獨診斷的最佳臨界值對子癇前期進行聯合檢測，聯合檢測診斷子癇前期的AUC為0.914(95%CI：0.865～0.964)，靈敏度為88.7%，特異度為68.3%。見圖2。

圖2 血清miR-21、miR-125b單獨及聯合檢測對子癇前期診斷的ROC曲線分析

3 討 論

子癇前期是臨床常見疾病，主要表現為妊娠20周后出現高血壓并伴有反復蛋白尿，可致孕婦腎臟、肝臟或神經等系統受損，亦可抑制胎兒生長，嚴重影響孕婦、胎兒的健康[6-7]。子癇前期發病機制尚不十分明晰，除環境、心理等因素外，母體抵抗力、胎盤及胎兒生長不佳也可影響其發病[8]。研究認為，多種原因造成胎盤滋養細胞功能缺陷而出現細胞缺血、缺氧，激活細胞發生應激反應、炎癥應答等，應激因子、炎癥因子進入血液循環導致血管內皮細胞受損，進而造成子癇前期的發生、進展[9-10]。因此，早期對子癇前期進行及時、準確的診斷，干預其病理、生理進展，對預防嚴重妊娠并發癥、延長孕周、保護母嬰健康均有積極意義。疾病診斷的生物標志物應具備較好的預測價值，較高的特異度和靈敏度，并在體內穩定存在，有較長檢測窗口期。本研究結果顯示，血清miR-21、miR-125b在子癇前期患者中表達存在差異，并且與子癇前期嚴重程度有一定關系，說明血清miR-21、miR-125b可能作為子癇前期無創診斷標志物。

miRNA在人體內廣泛存在，其自身并不編碼蛋白質，而是通過與特定靶基因結合來調控基因表達，在細胞分化、增殖、凋亡等病理、生理過程中發揮重要作用。此外，越來越多的研究發現，miRNA不僅通過自身表達變化在疾病發生、進展過程中發揮抑制或促進作用，而且在血液循環中也存在差異性表達[3,11]。血清核酸物質檢測被認為是無創診斷未來的發展方向，在疾病發生早期DNA、RNA等核酸物質釋放入血，并可長期、穩定存在于血液循環中，通過對它們的檢測能夠較早地對疾病進行診斷、預判而讓患者獲益[12]。本研究發現，子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對表達水平均高于健康妊娠孕婦，且組間比較顯示，重度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b相對表達水平要明顯高于輕度組。有研究發現，在子癇前期患者胎盤組織中血清miR-21、miR-125b表達明顯增加[6,13]，提示二者可能參與子癇前期的發生。當滋養細胞缺血、缺氧而致血管內皮細胞出現炎癥應答時，血清miR-21可加快B細胞活化而促進細胞因子、趨化因子分泌，進一步促進炎癥應答，加重胎盤血管內皮細胞損傷[14]。血清miR-125b參與子癇前期發生的可能機制為血清miR-125b靶向作用于鞘氨醇-1-磷酸受體基因，再通過復雜信號通路誘導白細胞介素8的表達，導致局部炎性反應的增強[15]。此外，血清miR-125b還可能通過鉀離子通道調控蛋白KCNA1來抑制人類滋養細胞的侵襲，造成滋養細胞功能缺陷，導致子癇前期的發生[16]。

收縮壓、舒張壓升高是子癇前期的診斷標準之一，并且與疾病預后密切相關。本研究中，一般資料比較結果顯示，子癇前期患者收縮壓、舒張壓較健康妊娠孕婦明顯升高，新生兒體質量明顯下降，并且重度子癇前期患者更為明顯，這與多數子癇前期研究結果相符[6-9]，提示本研究納入病例無明顯偏差。由于小血管痙攣而致血壓升高、灌注不足，子癇前期患者多存在不同程度的腎臟受損。本研究進一步分析患者血清miR-21、miR-125b與腎功能指標的相關性，結果顯示，血清miR-21、miR-125b與24 h蛋白尿、Scr、BUN呈正相關(P<0.05)，提示miR-21、miR-125b可能與子癇前期疾病進展存在相關性，尤其是對子癇前期合并腎損傷具有一定預測價值。子癇前期可抑制胎兒宮內生長，并且隨著病程、疾病嚴重程度增加胎兒受抑制更為明顯。本研究發現，血清miR-21、miR-125b與胎兒體質量呈負相關，提示血清miR-21、miR-125b對子癇前期患者圍產兒結局可進行預判。

本研究ROC曲線結果顯示，血清miR-21、miR-125b對子癇前期具有單獨診斷價值，而將二者聯合檢測可增加診斷效能。可溶性血管內皮生長因子受體-1與胎盤生長因子比值(sFlt-1/PlGF)是目前臨床常用子癇前期診斷指標，但是PlGF隨著孕周增加而增加，在30周左右才能達到峰值；此外，子宮循環發生在妊娠10周左右，而PlGF失衡多在孕晚期，因此，sFlt-1/PlGF對子癇前期早期診斷價值有限[17]。miRNA作為終端蛋白表達的調控物質，在疾病存在蛋白組學改變之前即可出現變化，并且進入血液循環后可穩定存在，是較好的子癇前期診斷標志物。