CAR-T細胞構建技術研究進展*

張 蘋，翟建昭，劉在栓，趙旭東 綜述，武永康△ 審校

四川大學華西醫院：1.實驗醫學科；2.腫瘤動物模型創制及應用研究室，四川成都 610041

嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)是過繼性免疫治療方法之一，通過對T細胞進行修飾，使T細胞表達靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CARs)，從而特異性識別腫瘤抗原，清除癌細胞，達到臨床緩解甚至是根治腫瘤的目的[1]。CAR-T細胞制造中，CARs的設計和基因轉導是兩個重要方面，前者著重于CARs本身的構造，不同的CARs結構在誘導信號傳導、發揮細胞效應等方面不同，通過CARs結構的優化，可以達到特異性、親和性及毒性之間的平衡，增加抗腫瘤效應[2]。后者強調基因轉移的效率、安全性，并與CAR-T的治療成本相關。CAR-T產品的制造昂貴、費時，并且復雜多樣。完整的CAR-T細胞制造流程如下：首先，對患者或捐獻者外周血中T細胞分離、富集及激活;其次，將編碼目的基因的CARs在體外與T細胞進行基因轉導獲得CAR-T細胞，然后對CAR-T細胞進行擴增以達到臨床治療所需劑量;最后,再應用于臨床治療[3]。

1 CARs的基本構造及演變

CARs這一概念在1989年由GROSS等[4]在研究中首次提出，它是一個合成受體蛋白，由識別并結合靶抗原的單鏈可變片段(scFv)的胞外區、鉸鏈區、跨膜區及CD3ζ鏈組成的胞內區4部分組成[5]。根據胞內區的結構不同，CARs分為4代[6]：第1代CARs只有傳導活化信號的CD3ζ鏈或FcεRIγ，缺乏持久性及增殖能力；第2代CARs在第1代的基礎上添加了共刺激分子CD28、4-1BB、OX40、ICOS等，滿足T細胞活化的2種信號，是應用最廣泛的CARs；第3代CARs將共刺激分子增加到2個,在研究中顯示出了更強的體外激活及增殖能力[7]；第4代CARs在第2代基礎上添加了白細胞介素-12，增強CAR-T療效的同時也避免了全身使用細胞因子帶來的不良反應。

2 治療靶點選擇及優化

合理地選擇和利用靶點是決定CAR-T療效的關鍵之一。與T細胞受體不同，CAR-T利用抗原與抗體、受體與配體結合的特異性，通過T細胞與靶細胞接觸釋放顆粒酶/穿孔素破壞細胞，不依賴主要組織相容性復合體(MHC)抗原呈遞識別，不僅可以用于下調MHCⅠ類分子導致免疫逃逸的腫瘤疾病治療，也能夠識別除蛋白質以外的糖類、脂類等靶向物質[8]。CAR-T治療中，理想的靶點應該是對腫瘤有高特異性、廣泛的腫瘤覆蓋范圍且抗原表達穩定，以此保證腫瘤清除的安全性和效能[9]。

獲取理想的靶點非常困難，通過對靶點選擇及CARs結構的優化可以增強靶點的性能[10]：使用2個靶抗原構建雙CARs或者在一個CARs上連接2個scFv，通過靶點的識別互補，可以擴大靶點覆蓋范圍；將CD3和胞內共刺激分子分開構建2個CARs，或者將正常結構CARs聯合一個抑制性CARs[胞內區連接抑制性分子如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡受體1(PD-1)]構建雙CARs,前者僅在雙靶點共同表達時完全激活，后者通過非腫瘤細胞的結合導致正常CARs激活的抑制，均可提高治療靶點的特異性。同時，基因突變產生的新抗原具有腫瘤特異性，它主要以肽/HLA復合物的形式存在，因此，靶向肽/HLA復合物構建CARs是治療的理想靶點。研究中，利用親和素、熒光素、亮氨酸拉鏈等標記的scFv制造的通用型CAR-T，能識別多種靶抗原，可用于治療高異質性實體腫瘤。

3 scFv的合成技術及研究進展

獲取針對靶抗原的scFv基因序列，是構建CARs的重要前提。scFv是具有抗原結合能力的免疫球蛋白分子的最小單位，通過基因工程將抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)以VH-linker-VL或者VL-linker-VH的順序連接形成(前者使用頻率更高)[11]，并決定了CARs的特異性。目前，獲取scFv的方法很多，并且技術成熟度較高。

1975年研究者發展了雜交瘤技術，通過將抗原免疫的小鼠脾臟B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，產生永生并大量擴增的單克隆抗體細胞群[12]。現在，雜交瘤細胞也被用于篩選Fab、scFv等單克隆抗體片段。在靶向CD19的CAR-T治療中， 多采用FMC63小鼠雜交瘤細胞，通過對其總RNA進行抽提并反轉錄生成cDNA，并針對可變區不同序列設計引物進行PCR擴增，最后對重鏈和輕鏈可變區DNA測序，成功構建scFv[13]。由于單克隆抗體多為鼠源性，會產生人抗鼠抗體反應[14]。采用基因工程技術對小鼠抗體進行嵌合、人源化及去免疫改造，可降低其免疫原性[11]。但是，采用雜交瘤細胞產生單克隆抗體費力且耗時，小鼠為小型哺乳動物，靈敏度不高，并不能夠對特異性抗原產生高親和抗體反應，在一定程度上限制了該技術的使用[15]。

隨著重組DNA技術和抗體工程技術的發展，1990年，MCCAFFERTY等[16]研究發現，scFv能夠作為一個功能性蛋白在噬菌體表面展示并保持其抗原結合域的活性，以此為基礎發展的噬菌體展示技術是第一個也是最廣泛使用的抗體體外篩選技術[17]，它可以產生包含數百萬甚至數十億種不同肽或蛋白質的抗體庫[18]，幾乎可以篩選出任意抗原對應的特異性抗體。大多數噬菌體展示技術使用M13絲狀噬菌體[19]，重組抗體基因首先插入到噬菌體外殼蛋白中，然后導入受體菌(如大腸桿菌)中增殖、成熟，重組抗體的基因就與噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式展示在了噬菌體表面，使用靶抗原經過多輪淘選就能獲取特異性抗體[17,20]。噬菌體篩選技術不依賴于體內免疫反應,能獲得傳統方法不能獲取的人類抗體或者抗自身抗原的抗體，它在細菌中增殖、培養，速度快、成本低，且噬菌體本身具有穩定保存的特性[15,21]，具有很好的臨床應用前景。

除了噬菌體展示技術，核糖體展示技術[22]、酵母表面展示技術、轉基因小鼠、單個B細胞分離[23]等技術都可用于獲取抗體片段。

4 基因轉導技術

4.1病毒轉導 CAR-T細胞生產過程中，需要一種運載工具，將CARs基因插入整合，以促進或抑制某種基因的表達。病毒具有進入細胞并傳遞遺傳信息到細胞內的能力，在基因轉導上應用廣泛[24]。目前，最常使用的病毒載體是反轉錄病毒科的γ-反轉錄病毒和慢病毒的復制缺陷載體系統[25]。結構上，所有的反轉錄病毒都有編碼病毒結構蛋白的gag基因、編碼病毒復制的反轉錄酶和整合酶的pol基因及編碼病毒包膜糖蛋白的env 3種基因，對于慢病毒，還有tat、rev 2個調節基因及vif、vpr、vpu、nef 4個輔助基因，負責編碼對病毒復制、結合、感染和釋放起重要作用的蛋白質[26]。基因轉導一般分為4步：(1)病毒編碼蛋白被目的基因替換，形成表達載體；(2)通過外源性補充gag、pol、env、rev(慢病毒所需)基因，提供合成病毒顆粒所需蛋白，形成包裝質粒；(3)表達載體、包裝質粒及env包膜質粒共轉染細胞(如293T細胞)進行培養；(4)對培養液上層細胞進行過濾并濃縮獲得高滴度病毒顆粒[27]，儲存在-80 ℃穩定保存4—9年[25]。病毒包裝系統是不斷優化的，通過將編碼基因分離構建包裝質粒、自身滅活長末端重復序列、去除所有不必要的序列和輔助基因等方式，可以避免病毒發生重組產生具有復制活性的病毒顆粒，增加病毒載體的安全性[28-29]。

慢病毒載體和反轉錄病毒載體都有很高的包裝容量，允許基因長期表達，并且都會導致整合位點的插入突變[30]，同時也各具特點。γ-反轉錄病毒載體是最早使CD19 CARs穩定表達的病毒載體[31]，具有很高的基因轉導效率，并且可以使用多種穩定的包裝系統，但只轉錄分裂期細胞[32]。相比之下，慢病毒載體應用更為廣泛，它具有高效的基因轉移效率和在目的基因穩定表達的特性，可以轉導非分裂期的細胞(不包括處于G0期的細胞)[33]，并且插入突變風險較反轉錄病毒低，表現出更安全的整合特性，但慢病毒缺乏廣泛使用的穩定包裝系統，也存在多質粒瞬時轉染帶來的批間差等問題[34]，因此，獲得慢病毒載體的方法復雜且昂貴。病毒轉導的主要優勢是相對容易制造、生產并且有穩定的基因整合能力。為了服從臨床安全標準，病毒載體必須證明無復制能力、低基因毒性及低免疫原性[27]。

除了逆轉錄病毒科，腺病毒相關病毒、腺病毒、單純皰疹病毒也用于基因轉導。腺病毒相關病毒可以轉導分裂期和非分裂期細胞，在轉導劑量下，一般沒有致病性或細胞毒性，其低基因整合率降低了插入突變的風險，最大的缺點是包裝容量小(<5 kb)；腺病毒也能轉導分裂期和非分裂期細胞，插入突變風險小，包裝容量大(最高達30 kb)，但存在輔助病毒的污染問題及在第1代載體系統中產生先天免疫反應等問題[35]；單純皰疹病毒是一個大容量載體(≥30 kb)，具有多個外源性基因插入位點，具有高效的基因轉導效率，但在腦部等組織中轉基因不能長期表達，并且存在載體靶向困難等問題[36]。

4.2非病毒轉導 轉座子是一種自然、可移動的遺傳因子，能夠改變自身在基因組中的位置，以一種非病毒的方法修改細胞基因組[37]。轉座子由轉座酶基因的DNA片段及兩側包含轉座酶結合位點的反向末端重復序列(TIRs)兩部分組成，轉座酶與TIRs結合，可切斷轉座子并改變其原有位置。CAR-T治療中，以睡美人轉座子系統和PiggyBac轉座子系統應用最為廣泛。以基于質粒的睡美人轉座子系統進行基因轉導為例，首先在TIRs之間引入CARs目的基因，將其轉入宿主基因組，然后將含目的基因的轉座子傳遞到細胞，通過轉座酶與轉座子的TIRs連接，催化轉座子的切除與隨后的基因整合，從而轉導目的基因[38]。與病毒載體相比，轉座子對基因的負載能力更強，操作步驟相對簡單，在臨床試驗中也表現出良好的轉導效率，且轉座子是無病毒的不連續的DNA片段，作為核酸載體，它的免疫原性可忽略不計，也不具有致病性，但具有相對安全的整合特性，不需進行昂貴的生物安全檢測，可以降低CAR-T治療成本[39]。但是，由于轉座子可隨機插入轉基因，帶來了臨床安全和效率問題，天然轉座子允許轉導的基因重復改變基因位置，增加了質量控制難度[40]。

mRNA介導的基因轉導技術提供了一個基于細胞質的表達系統，它突破了人們認為mRNA穩定性差，無法作為治療分子的固有思維。mRNA具有高效的轉導效率，能夠轉導靜止或緩慢增殖的細胞，體外轉錄的mRNA可通過電穿孔或內吞等方式進入細胞，不需進入細胞核調節其功能，因此，mRNA不能整合到基因組中，插入突變的可能性非常低。但是，mRNA由于本身具有不穩定和存活時間相對較短的特性，會導致編碼的蛋白質相對短暫的表達[41]。

5 符合藥品生產質量管理規范(GMP)標準的CAR-T細胞產品制造

CAR-T細胞制造的失敗率在2%～14%[42]，主要是由于患者T細胞數量少、單核細胞/粒細胞等對白細胞分離產物的污染及難以獲得足量的CAR-T細胞進行治療等問題造成。作為細胞免疫療法中的一種，CAR-T細胞的生產必須符合GMP，并且進行完整詳盡的質量控制以保證其治療的安全性及有效性。在獲取T細胞時，選取合適時間點采集患者T細胞(如化療前)、使用健康捐獻者外周血構建通用型CAR-T來優化T細胞產量[43]；在T細胞富集過程中，通過去除潛在的抑制細胞群(如單核細胞和粒細胞)及選取特定的T細胞亞群，提升標本純度以達到最佳的細胞終產量；在T細胞增殖中，選取封閉、自動化儀器進行T細胞擴增[44]，避免污染的同時也保證了細胞質量。CAR-T細胞必須經過產品鑒別、純度、生存能力、效力等方面的測試，包括對表達目的基因細胞系的細胞毒性檢測及純度檢測，以及在產品冷凍前進行存活率檢測等[42]。

6 總結及展望

構建效能強、安全性高的CAR-T細胞是CAR-T精準高效治療的基礎，選取最優的靶點，構建效能最佳的CARs結構，獲取最符合特定疾病治療所需的T細胞，進行安全高效的基因轉導及充分的細胞擴增，并且在制造全程進行質量控制，是CAR-T作為藥物治療疾病的關鍵環節。雖然CAR-T價格高昂、自動化程度不高，很難將CAR-T應用于更廣泛的治療人群，但隨著研究進展，結構缺陷及技術短板等方面的難題逐漸解決，無疑會有更多安全、高效的CAR-T細胞產生并應用于臨床，CAR-T細胞治療的潛力是值得期待的。