DNA甲基化在乳腺癌中的研究進展*

鄧長娟 綜述，謝小兵 審校

1.湖南中醫藥大學，湖南長沙 410001；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗與病理中心，湖南長沙 410000

根據國際癌癥研究機構(IARC)在2020年發布的數據,全球乳腺癌新發病例預計高達226萬例，其死亡病例數約為68萬，排名第五，但在女性中排名第一，同時乳腺癌也是中國女性最常見的癌癥，中國2020年的新發病例數預計為42萬，占全世界的18.6%，死亡約為12萬，占全世界的17.6%[1]。乳腺癌的發病原因較多，如飲食習慣、生活方式的改變、肥胖、生殖因素和長期的內源性雌激素接觸(初潮早、絕經晚、未產婦或高齡首次次足月妊娠)等是女性乳腺癌的重要危險因素[2-4]。同時，研究表明，乳腺癌的發生與表觀遺傳改變密切相關[5]。表觀遺傳學即DNA的堿基排列不變，但是由于某些原因使基因的表達出現了可以遺傳的變化。一般認為表觀遺傳學包括DNA、RNA和組蛋白的修飾及染色質三維結構改變等，現在發現至少有4種DNA和16種組蛋白修飾，其中對DNA甲基化的研究最深[6]。DNA甲基化描述了DNA甲基化轉移酶(DNMT)將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的一個甲基與胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)上胞嘧啶殘基第5位碳原子結合，生成5′-甲基胞嘧啶(5mC)的過程[7]。目前有5種與真核生物相關的DNMTs，分別為DNMT1、DNMT2、DNMT3L、DNMT3a、DNMT3b[8]。本文綜述DNA甲基化在乳腺癌發生、發展中的分子機制及在早期篩查、預后和靶點治療等方面的研究進展，并對未來的研究提出建議和展望。

1 DNA甲基化與腫瘤

在人體中，CpG含量較低，而在啟動子和第一外顯子區域，富集CpG位點，這個富集CpG位點的區域被稱為CpG島(CGI)[9]。當抑癌基因CGI過度甲基化時，DNA的轉錄過程被抑制，造成惡性腫瘤的發生，DNA甲基化可以沉默各種不同類型的基因。同時，致癌基因反常低甲基化也與惡性腫瘤密切相關[10]。啟動子區域的低甲基化使基因處于異常活躍狀態，產生一些異常蛋白質，破壞正常細胞結構，使細胞的功能紊亂并由此引發癌癥[11]。GGI的甲基化過高或過低與癌癥的發生關系密切，而全基因組低甲基化也與癌癥的發生關系密切。MOORE等[12]研究發現，白細胞基因組DNA低甲基化會增大膀胱癌風險，全基因組DNA低甲基化會引起染色體不穩定并導致癌癥發生，此后又有學者發現，在中國血液白細胞DNA的特異性核基質蛋白-4(BLCA-4)重復序列中檢測到總體甲基化不足的個體患乳腺癌的風險增加，并且表明BLCA-4低甲基化可能是乳腺癌患者預后不良的有用生物標志物[13]。

2 DNA甲基化與乳腺癌

基因啟動子甲基化在乳腺癌中非常普遍，超過100個基因啟動子被報道有高甲基化現象[14]，包括(1)細胞周期調控基因，如細胞周期蛋白D2基因(CCND2)和細胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)[15-16]；(2)DNA修復基因，如乳腺癌易感基因1(BRCA1)、乳腺癌易感基因2(BRCA2)[17-18]、胱甘肽S轉移酶P1基因(GSTP1)[19]；(3)組織侵襲和轉移基因，如Ras相關區域家族1A基因(RASSF1A)[20]、視黃醇受體β基因(RARβ)[21]；(4)細胞轉錄基因，如同源框基因A基因(HOXA1、HOXA5、HOXA9、HOXA10等)[22-23]；(5)細胞黏附基因，如鈣黏著蛋白1基因(CDH1)[24]；(6)激素介導的細胞信號傳導基因，如雌激素受體α基因(ERα)[25]。原癌基因啟動子低甲基化也會導致癌癥發生，如三葉因子1基因(TFF1)[26]，這表明基因甲基化在乳腺癌生長和轉移中發揮重要作用。

3 DNA甲基化在乳腺癌早期篩查中的作用

目前，大多數乳腺癌患者在確診時就已經是晚期或者轉移階段[27]，因此，癌癥早期篩查標志物意義重大。乳腺癌的輔助檢查手段主要有體格檢查、超聲檢查、鉬靶檢查、核磁共振檢查。超聲和鉬靶檢查具有假陽性高、射線暴露、疼痛、焦慮和負面心理等缺點[28]，假陽性會導致對乳腺癌的過度診療[29]，而核磁共振檢查價格昂貴。因此，尋找新的足夠靈敏和特異的經濟型癌癥篩查預后生物標志物意義重大。

DNA甲基化修飾參與癌癥早期過程，并且隨著癌癥進展，其DNA甲基化出現了不同模式。近年來大量文獻研究了循環或無細胞 DNA(cfDNA)甲基化狀態在包括乳腺癌在內的各種腫瘤診斷與預后中的作用[30-34]，cfDNA檢測具有采集方便、無創、可重復的優點，在檢測診斷中具有廣闊前景。有研究指出，在三陰性乳腺癌中，BRCA1啟動子在cfDNA和組織標本中的甲基化水平差異無統計學意義[18]，在乳腺癌患者外周血中，APC、FOXA1、RASSF1A、BRCA1、ATM等基因啟動子甲基化頻率相對于健康者更高[31,35-39]。因此，cfDNA作為生物標志物在癌癥檢測中具有廣闊的應用前景。

但是cfDNA在外周血與正常細胞DNA中同時存在，這會導致特異度降低；cfDNA在健康者外周血中的水平為5～20 ng/mL,并且通過檢測母體中胎兒游離DNA發現其半衰期平均為16.3 min，這些都導致cfDNA作為生物標志物靈敏度降低。但是聯合檢測多種特異性cfDNA可以提高檢測靈敏度與特異度。

4 DNA甲基化在乳腺癌預后中的作用

DNA甲基化除了在乳腺癌早期篩查中發揮作用外，還與患者不良預后密切相關。研究人員發現類成對同源框轉錄因子2基因(PITX2)的甲基化使乳腺癌不良預后風險增大[40]；MEHROTRA等[41]研究發現，與乳腺癌遠處轉移相關的基因CCD2、RAR-β、Twist、RASSF1A和HIN-1甲基化頻率在轉移性乳腺癌組織標本中較原發性乳腺癌高；并且研究表明乳腺癌患者甲基化水平與生存時間密切相關[42-43]。

5 DNA甲基化轉移酶抑制劑(DNMTi)與乳腺癌治療

DNA甲基化的變化是一種動態且可逆轉的過程，DNA去甲基化造成轉錄激活，重新表達沉默基因，這為癌癥提供了一種新思路。DNMTi下調基因甲基化水平，使由于高甲基化而沉默的基因重新表達以達到治療癌癥的目的。

目前，DNMTi主要用于治療骨髓異常增生綜合征(MDS)等血液系統惡性腫瘤，而在實體瘤中的臨床應用還在研究當中。美國食品藥品管理局(FDA)已批準地西他濱(5-氮雜胞嘧啶核苷)等DNMTi藥物用于臨床治療所有亞型的MDS。DNMTi能顯著改善患者生活質量，提高預期壽命[44-45],且DNMTi與組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(HDACi)聯合用藥具有協同作用，治療效果更好[46-48]。

DNMTi單獨或聯合其他抗腫瘤藥物在細胞實驗和動物實驗中的效果明顯，如地西他濱聯合經典抗腫瘤藥物聚ADP核糖聚合酶抑制劑(PARPi)對具有野生型或突變型BRCA甲基化導致的乳腺癌和卵巢癌有治療效果[49]，地西他濱可以反轉乳腺癌中蛋白激酶D1(PRKD1)啟動子甲基化，恢復PRKD1的表達并阻斷腫瘤向肺的擴散和轉移[50]。但是一項關于用于地西他濱聯合HDACi(恩替司他)用于治療晚期乳腺癌臨床試驗未能達到預期效果的研究表明，DNMT抑制劑在乳腺癌中的臨床治療效果尚待研究，同時DNMTi治療乳腺癌的最佳劑量和方案尚未得到充分研究[51]。

6 DNA甲基化常見的檢測方法

6.1限制性酶切PCR法(RE-PCR) RE-PCR是最早的DNA甲基化檢測技術。其基本原理為：使用兩種專門的限制內切酶處理DNA后，這兩種酶分別對甲基化靈敏和不靈敏。根據甲基化片段上下游的堿基排列來確定引物的PCR擴增。DNA有甲基化現象，則含有甲基化位點的這段基因將被擴增，否則無法擴增。RE-PCR操作簡單，成本低，但這個方法需要大樣本檢測且只能檢測限制性內切酶識別的CpG島甲基化狀態，當酶切不完全時易出現假陽性。

6.2甲基化特異性PCR法(MSP) MSP是經典的甲基化檢測方法，亞硫酸氫鈉處理DNA后，未甲基化DNA序列中的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基胞嘧啶不改變。按照兩種堿基序列，分別設計甲基化引物和非甲基化引物進行PCR擴增，凝膠電泳檢測擴增片段確認基因是否發生甲基化。該方法操作簡單、費用較低且特異度較高，但只能對已知甲基化位點的序列進行檢測，并且不能定量分析甲基化水平。

6.3重亞硫酸鹽測序法(BSP) BSP同樣先用亞硫酸氫鈉預處理DNA，接著設計兩種引物進行PCR，再經過克隆、測序等步驟可以得知DNA序列中單獨CpG位點是否發生了甲基化。該方法特異度和靈敏度都很高，但是操作復雜，成本也較高。

6.4甲基化敏感性高分辨率熔解曲線法(MS-HRM) 高分辨率熔解法(HRM)最初是用來檢測單核苷酸多態性基因分型的，后被完善用于DNA甲基化檢測。其同樣經亞硫酸氫鹽處理，PCP擴增得到兩種產物。根據兩種產物熔解曲線不同并以此檢測DNA甲基化水平。MS-HRM操作較簡單，靈敏度高且成本較低，但是只能用來檢測DNA總體甲基化水平，無法檢測單個CpG位點甲基化狀態。

6.5甲基化熒光檢測法 甲基化熒光檢測法是高通量檢測，該方法同樣先用亞硫酸氫鈉處理DNA,接著設計引物和TaqMan 熒光探針來進行PCR擴增，根據獲得的熒光信號得知DNA甲基化狀態。甲基化熒光檢測法具有靈敏度高的特點，能夠在超過10 000倍未甲基化等位基因的情況下檢測甲基化等位基因。甲基化熒光檢測法過程比較簡單、定量準確、特異度高，能夠快速篩查腫瘤，但同時檢測成本也較高。

6.6焦磷酸測序法 焦磷酸測序法是DNA甲基化檢測結果的“金標準”，是第3代測序技術。同樣先用亞硫酸氫鈉處理DNA，隨后進行焦磷酸測序，最后進行甲基化分析。焦磷酸測序能夠定量精確到單個位點。

7 小 結

近年來大量研究均證實，DNA甲基化與乳腺癌的發生、發展、預后等密切相關，DNA甲基化是一個具有廣闊應用前景的研究方向。cfDNA甲基化改變作為篩查手段,能夠對傳統乳腺癌篩查起到補充或者改進的作用，并且多項研究表明，聯合多種特異性甲基化指標能提高乳腺癌診斷的特異度和靈敏度。此外，腫瘤或鄰近組織或外周血中的DNA甲基化改變也可以幫助臨床醫生確定乳腺癌的預后和療效。同時DNMTi在MDS中的成功應用也為乳腺癌治療開拓了新思路，并且已有動物和細胞實驗表明DNMTi與其他抗腫瘤藥物聯合使用能得到更好的療效。但是，DNMTi在乳腺癌中的臨床應用還需要廣大研究人員不斷深入研究。甲基化檢測的方法隨著測序技術的發展也越來越先進，極大地推進了甲基化研究進展。總之，DNA甲基化作為乳腺癌生物標志物的臨床應用及實現臨床治療還需要進一步的研究。