1例COVID-19患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化及意義*

宣彬彬，孫寒曉，武嬌祥，周麗達(dá)，陳佳婕，譚美玉，殳 潔，李 陽(yáng)，陶生策，盛慧明△

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200336；2.上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是單鏈正義RNA病毒，屬于β類冠狀病毒，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)同種屬[1-2 ]。現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的傳染性和病死率都非常高，圍繞該病毒的診斷和治療亟待突破。尤其是對(duì)病毒感染免疫的研究將在實(shí)驗(yàn)室診斷和疫苗的研發(fā)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本文就上海首例COVID-19患者整個(gè)診治過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化進(jìn)行報(bào)道，為COVID-19的診斷治療提供信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院收治的上海首例COVID-19患者門(mén)診及住院治療期間的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。患者，女，57歲，漢族。出生地湖北。因“發(fā)熱 5 d，伴干咳加重 2 d”于2020年1月16日收入上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，經(jīng)過(guò)治療后于2020年2月24日康復(fù)出院并隨訪。該患者在入院前6天(1月10日)即有臨床癥狀并曾于武漢中醫(yī)院就診，本研究中將此作為疾病發(fā)生第1天(D1)，以此類推，至2月24日出院為D46。本研究已獲醫(yī)院倫理批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2體格檢查 患者體溫升高，38.2 ℃，胸悶，咽部不適，畏寒無(wú)寒戰(zhàn)，咳嗽，無(wú)咳痰，下肢乏力，背部及下肢肌肉酸痛，無(wú)呼吸困難，無(wú)盜汗，無(wú)胸痛，無(wú)鼻塞流涕，無(wú)頭暈、頭痛，無(wú)皮疹。查體：神志清醒，氣平，發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)良好，急性病容，表情正常，自主體位，正常步態(tài)，對(duì)答切題，查體合作。脈搏92次/分鐘，呼吸24次/分鐘，血壓105/65 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，心率92次/分鐘，律齊，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及病理性雜音和額外心音；無(wú)心包摩擦音。無(wú)水沖脈，無(wú)股動(dòng)脈槍擊音，無(wú)毛細(xì)血管搏動(dòng)征。肺部檢查：雙側(cè)胸廓呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，雙側(cè)語(yǔ)顫對(duì)稱正常，雙肺叩診清音，雙肺下葉聞及濕啰音。肝脾肋下未及，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，肢體無(wú)水腫及皮疹。X線片檢查結(jié)果：兩肺多發(fā)炎癥。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本采集 患者的血液標(biāo)本均由臨床護(hù)士采集，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目不同采用不同抗凝劑真空采血管，并經(jīng)過(guò)離心后留取標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。咽拭子等呼吸道標(biāo)本則由臨床醫(yī)生采集并及時(shí)送檢。

1.3.2儀器與試劑 美國(guó)BD公司FACS CantoTMⅡ流式細(xì)胞儀、MultitestTM6-color TBNK 試劑盒、絕對(duì)計(jì)數(shù)管；青島瑞斯凱爾12項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒；深圳邁瑞B(yǎng)C-5390 全自動(dòng)五分類血液細(xì)胞分析儀；德國(guó)西門(mén)子ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀；丹麥雷度ABL90血?dú)夥治鰞x；北京熱景生物技術(shù)股份有限公司SARS-CoV-2 IgM抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金免疫層析法)；北京新興四寰生物技術(shù)有限公司SARS-CoV-2 IgG抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)。

1.3.3檢測(cè)項(xiàng)目 本次研究針對(duì)患者不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，包括血常規(guī)、凝血6項(xiàng)等常規(guī)項(xiàng)目檢測(cè)，并對(duì)患者的淋巴細(xì)胞亞群分布、炎癥指標(biāo)及細(xì)胞因子進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。此外，也將患者的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本送往上海市疾病預(yù)防控制中心病原生物檢定所病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。該患者D8血漿標(biāo)本在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室采用圣湘生物(長(zhǎng)沙)新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)。并將患者血清標(biāo)本送至上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究院通過(guò)蛋白芯片檢測(cè)患者血清中SARS-CoV-2的S1蛋白和N蛋白抗體表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1一般實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果 本研究收集該例患者在入院診治過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的血液標(biāo)本并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)(表1)。在感染早期，患者的白細(xì)胞略有降低，且淋巴細(xì)胞的數(shù)量低于正常值，血小板出現(xiàn)過(guò)程性消耗后逐步恢復(fù)(圖1A)。炎癥指標(biāo)C反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平在疾病進(jìn)展過(guò)程中持續(xù)保持升高的狀態(tài)，SAA水平變化差異較CRP水平更加明顯，繼發(fā)纖溶指標(biāo)D二聚體水平有階段性升高，與血小板消耗相吻合(圖1B)。為了更好地探究淋巴細(xì)胞數(shù)降低對(duì)患者免疫功能的影響，將淋巴細(xì)胞亞群的百分比、絕對(duì)計(jì)數(shù)的結(jié)果也進(jìn)行匯總，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞亞群數(shù)量均降低，并隨著患者病情的好轉(zhuǎn)逐漸恢復(fù)，而淋巴細(xì)胞亞群的百分比則呈波動(dòng)狀態(tài)(圖1C)。對(duì)該患者外周血的細(xì)胞因子分泌情況的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-6等水平均高于正常范圍，從折線圖中可以看出患者在D8存在病情加重的情況，除細(xì)胞因子的結(jié)果外，該患者的淋巴細(xì)胞亞群的分布變化也與這一病程相符(圖1C、D)。

表1 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

注：A表示白細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)結(jié)果；B表示CRP、SAA及D二聚體檢測(cè)結(jié)果；C表示淋巴細(xì)胞亞群及其絕對(duì)計(jì)數(shù)；D表示細(xì)胞因子分泌情況。

2.2分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果 鑒于患者在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院就診時(shí)其臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示可能為COVID-19的感染者。故在入院后對(duì)其采樣，送檢進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)及測(cè)序分析，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，在病情加重時(shí)可以在血液標(biāo)本中檢測(cè)出病毒的存在。

2.3血清學(xué)病毒抗體結(jié)果 對(duì)患者不同時(shí)間點(diǎn)采取的血清標(biāo)本，檢測(cè)其IgM和IgG含量。患者發(fā)病后1周左右(D8)就可見(jiàn)到IgM的表達(dá)，而IgG抗體則在D10才可以用膠體金法檢測(cè)出來(lái)(圖2A)。為了更好地了解患者血清中針對(duì)病毒抗體的種類，進(jìn)行了蛋白芯片檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出，患者血清中抗S1蛋白抗體和抗N蛋白抗體的出現(xiàn)時(shí)間及含量存在差異，對(duì)抗S1蛋白抗體而言，無(wú)論是其IgM還是IgG的出現(xiàn)均早于抗N蛋白抗體，并且表達(dá)量也明顯較高(圖2B、C)。

表2 患者核酸檢測(cè)相關(guān)結(jié)果

注：A表示患者血清標(biāo)本IgM和IgG膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果；B表示患者血清標(biāo)本SARS-CoV-2的S1蛋白及N蛋白的抗體變化(顏色越深抗體檢測(cè)含量越高)；C表示蛋白芯片結(jié)果(D25):該蛋白芯片除包含SARS-CoV-2的S蛋白及N蛋白以外，其余為S蛋白的S1和S2部分切割成的200余條小肽，各蛋白質(zhì)以斜三點(diǎn)點(diǎn)陣附著在蛋白芯片上。

3 討 論

COVID-19病毒潛伏期一般為3～7 d，但亦可長(zhǎng)達(dá)14 d以上。臨床上以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)。但重癥病例多在1周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。在發(fā)病早期外周血白細(xì)胞總數(shù)正常或減低。多數(shù)患者CRP和紅細(xì)胞沉降率升高，降鈣素原水平正常。嚴(yán)重者D二聚體水平升高，外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少，與本次研究患者基本相符(圖1A、B)。在本次研究中，該患者于D1在武漢因口咽部不適就診，并在回上海后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀并且咳嗽加重，故于D6前往上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院就診。經(jīng)過(guò)對(duì)該名患者多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，可以看出隨著其病程變化，各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律(表1、圖1)。

該名患者住院期間白細(xì)胞總數(shù)雖有波動(dòng)但基本處于正常范圍之內(nèi)，對(duì)疾病的診斷及監(jiān)測(cè)意義并不明確，但是淋巴細(xì)胞數(shù)持續(xù)處于下降的狀態(tài)；CRP與SAA水平在疾病期均高于正常范圍，并且與CRP水平相比，SAA水平的增高更加明顯，能夠更好地反映患者體內(nèi)的炎癥狀況；血小板的數(shù)量在發(fā)病期間也明顯低于恢復(fù)期，其原因可能是在發(fā)病期間體內(nèi)存在凝血激活，這也可與其D二聚體水平升高的表現(xiàn)相互印證(圖1A、B)。根據(jù)患者的病程發(fā)展，其在D8這一天有明顯的癥狀加重過(guò)程，包括出現(xiàn)D二聚體水平升高，各淋巴亞群數(shù)量明顯減低，血?dú)饨Y(jié)果異常，并且總T細(xì)胞，CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量大大減少，D8下午的檢測(cè)結(jié)果僅分別為267/μL，154/μL和93/μL，T細(xì)胞耗竭嚴(yán)重(圖1D)。說(shuō)明COVID-19患者其淋巴細(xì)胞及各亞群數(shù)量的下降可能與其疾病程度密切相關(guān)。而與淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)相比，各淋巴細(xì)胞亞群百分比的變化卻并不能很好地體現(xiàn)這一點(diǎn)，整體來(lái)說(shuō)變化幅度一般，沒(méi)有如CD3+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)那樣在D8明顯下降，且隨著疾病好轉(zhuǎn)不斷恢復(fù)上升。所以與淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)比例比較，絕對(duì)計(jì)數(shù)的臨床價(jià)值更大。患者的細(xì)胞因子結(jié)果尤其是IL-6的數(shù)值在D8明顯升高，且患者D10的檢測(cè)結(jié)果提示其血氧飽和度僅為92.6%提示患者病情加重(表1)，故可推測(cè)細(xì)胞因子的相關(guān)指標(biāo)變化可以更早地提示患者的免疫狀況，反映病情進(jìn)展，在觀測(cè)患者疾病程度變化過(guò)程中存在預(yù)警性的臨床價(jià)值(圖1C)。目前有相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為，外周血中T細(xì)胞數(shù)量與血清IL-6、IL-10和TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)，而該患者在D8表現(xiàn)為IL-6水平升高，T細(xì)胞數(shù)量明顯下降[3 ](圖1C、D)。而該患者雖然淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，IL-6水平明顯升高，但并未產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴現(xiàn)象，疾病得到控制，并在治療下逐漸好轉(zhuǎn)至出院。

目前對(duì)于SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室檢查的確診方式還是病毒核酸檢測(cè)及DNA測(cè)序，常用的核酸檢測(cè)靶標(biāo)有ORF1ab基因、N基因、E基因[4]。而病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素影響，包括采樣方式、病毒載量、運(yùn)輸保存及實(shí)驗(yàn)操作等。本研究中患者D7結(jié)果中鼻咽拭子查出ORF1ab基因、N基因、E基因均為弱陽(yáng)性，而痰液標(biāo)本只有ORF1ab基因、N基因檢測(cè)出弱陽(yáng)性，血液標(biāo)本未檢出。為此D8重新采樣復(fù)查結(jié)果陽(yáng)性，并且基因測(cè)序結(jié)果也與其相符。對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行ORF1ab基因、N基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ORF1ab基因結(jié)果陽(yáng)性(表2)。說(shuō)明不同標(biāo)本類型對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響不同，不同基因片段的檢測(cè)結(jié)果也存在差異。而結(jié)合患者在D8這一天存在癥狀加重的情況，提示可能出現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥，導(dǎo)致可以在血液標(biāo)本中檢測(cè)出SARS-CoV-2。

人體對(duì)于病原體感染的抵抗，主要依賴自身的免疫系統(tǒng)，隨著病毒感染，體內(nèi)逐漸產(chǎn)生針對(duì)病原體的抗體對(duì)抗病毒損傷。IgM作為初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，能在短時(shí)間內(nèi)起到對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，而IgG出現(xiàn)則略晚。根據(jù)膠體金免疫層析法研制生產(chǎn)的試劑盒由于其檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)可以作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。對(duì)于本次研究的患者而言，其在發(fā)病1周左右可以檢測(cè)出IgM抗體，而IgG抗體的檢出則要晚幾天。隨著患者臨床癥狀的好轉(zhuǎn)，IgG抗體的數(shù)量明顯增加，并且IgM抗體的含量仍然較高[5]，直到D46仍可檢出(圖2A)。而一般病毒的IgM抗體的持續(xù)時(shí)間為2周到1個(gè)月，SARS-CoV-2的IgM抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的原因尚待探究，但應(yīng)該警惕病毒感染由急性轉(zhuǎn)為慢性的可能。為了更進(jìn)一步研究患者體內(nèi)的抗體變化，將標(biāo)本進(jìn)行了蛋白芯片相關(guān)檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)患者外周血中刺突蛋白S1對(duì)應(yīng)的抗體，無(wú)論是IgM還是IgG均早于核心蛋白N對(duì)應(yīng)的抗體。而N蛋白對(duì)應(yīng)的抗體，IgM和IgG這兩種抗體出現(xiàn)的時(shí)間十分接近，并且含量較高(圖2B、C)。由此可見(jiàn)，SARS-CoV-2的S蛋白抗體在監(jiān)測(cè)病毒早期診斷上面的價(jià)值要優(yōu)于N蛋白抗體，并且已有相關(guān)研究證明SARS-CoV-2可以通過(guò)S蛋白與ACE2受體結(jié)合參與病毒侵入細(xì)胞內(nèi)部的生物學(xué)過(guò)程[6]。而通過(guò)蛋白芯片的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，S蛋白內(nèi)的很多小肽也可以和患者血清標(biāo)本中的抗體結(jié)合，說(shuō)明SARS-CoV-2的S蛋白上存在豐富的抗原表位，在實(shí)際檢測(cè)中需要考慮S蛋白抗體假陽(yáng)性的可能。

從上海首例COVID-19的整個(gè)收治過(guò)程中，對(duì)患者體內(nèi)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子指標(biāo)的變化有了一個(gè)動(dòng)態(tài)、系統(tǒng)性的觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子結(jié)果對(duì)其疾病進(jìn)程的發(fā)展有著重要的提示作用。血清抗體的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)COVID-19患者體內(nèi)產(chǎn)生的S1和N蛋白的IgM、IgG抗體的出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及表達(dá)強(qiáng)度存在差異，但如何更好地診斷和治療SARS-CoV-2感染，仍有待繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。